农用抗生素的研究与开发

农用抗生素的研究与开发

0大力生产和应用环保型生物农药在由各种病原体引起的植物感染中，约70%的疾病是由真菌引起的。长期以来,人们大量使用化学农药防治植物真菌病害,虽然短时间内收到了良好的经济效果,但是,随着时间的推移,化学农药造成的诸多问题也日益显现。由于化学农药的一些毒副作用以及人们对“绿色食品”要求的提高和环境保护意识的增强,研究开发和生产无公害的生物农药成为当务之急。农用抗生素作为生物农药的一个重要分支,因其具有高效、易分解、无残留、与环境相容性等优点日益受到人们的重视。近年来,人们逐渐认识到农用抗生素作为生物产生的活性化学物质,本质上和化学农药一样,是具有一定分子量的化学物质,也和化学农药一样有安全性及和环境的相容性问题。因此,研究开发新农用抗生素也应该和化学农药一样在阐明其化学结构的基础上对它的安全性及环境的影响进行详尽的研究,从而为研究农用抗生素的构效关系、作用机理以及应用化学修饰技术,对一些天然农用抗生素的结构进行改造提供了物质基础,进一步发挥农用抗生素的优越性,使其更好的农业于服务。1害生物的次级代谢农用抗生素是微生物产生的,可用于防治病、虫、草等有害生物的次级代谢产物。由于农用抗生素具有对人畜和非靶标生物安全,环境兼容性好,不易产生抗性,易分解等优点,在植物病害防治过程中发挥着越来越重要的作用。1.1世界药物的研究农用抗生素是随着医用抗生素的发展而发展起来的,它的研究始于美国、英国、日本等国科学家用医用抗生素如链霉素(Streptomycin)、土霉素(Oxytertracyline)、灰黄霉素(Griseofulvin)等来防治植物病害。随后,Dekker等相继报道了一批如放线菌酮(Cycloheximide)、抗霉素A(ActimycinA)以及一些多烯类农用抗生素。这一时期的农用抗生素发展比较缓慢。1958年,日本的Takeuchi等成功研制出杀稻瘟菌素S(BlasticidinS),并于1961年大面积应用于稻瘟病的防治,基本上取代了有机汞制剂在防治稻瘟病上的应用。杀稻瘟菌素S的发现和工业化,使农用抗生素的开发进入了新时期。继杀稻瘟菌素S之后,日本又相继开发了春雷霉素(Kasugamycin)、多氧霉素(Polyoxins)、有效霉素(Validmycin)等一系列高效低毒的抗真菌农药新品种。Tanaka&Omura研究表明,1988年总共发现了约8000种抗生素,其中43%是由日本学者发现的。到1996年所发现的抗生素类农药中,日本发现的约占2/3,可见,日本在这方面的研究已经走在世界的前面。世界抗生素研究在经历了20世纪70年代的高速发展期和80年代新品迭出期以后,进入90年代已迈入市场成熟期。一些防病效果好的杀菌剂如稻瘟菌素S(BlasticidinS)、春雷霉素(Kasugamycin)、有效霉素(Validmycin)等已经工业化生产,并在世界范围内推广使用,取得了良好的经济效益。1.2中国抗菌药的研究与开发现状中国是农用抗生素生产和应用大国,也是农用抗生素研究开展较早的国家,早在20世纪50年代就已经开始此类研究,由于当时经济条件的限制进展比较缓慢,到20世纪70年代以后逐渐取得了较大突破,进入了蓬勃发展时期。中国研制成功并在生产上推广应用的农用抗生素主要有:井冈霉素(Jinggangmycin)、多抗霉素(Polyoxins)、庆丰霉素(Qingfengmycin)、农抗120(Agriculturalantibiotic120)、武夷菌素(Wuyiencin)、中生菌素(Zhongshengmycin)等10多个品种。目前,大规模生产并且应用面积最大的品种是井冈霉素,年产值达到5亿多元。进入20世纪90年代,中国的抗生素研究开发又进入一个新的发展高潮,科研水平处于世界先进国家之列。目前,中国研究开发农用抗生素新品种的数量在不断增加,如西北农林科技大学从产生菌委内瑞拉链霉菌秦岭变种(Streptomycesvenezuelaevar.qinlingensisn.var.)中分离纯化出的瑞拉霉素(Zuelaemycin)对植物病原真菌有很强的抑制作用,该项成果已于2002年在西安通过鉴定。浙江省农科院植保与微生物研究所施跃峰等从刺孢吸水链霉菌天目山亚种(S.hygrospinosvar.tianmushanensisn.var.Sangeta1)发酵液中,分离纯化出一种核苷类抗生素——抑霉菌素(Yimeimycin),对瓜类白粉病菌、灰霉病菌、稻瘟病菌、稻纹枯病菌、炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌等病原真菌具有强抑制活性,抑霉菌素的开发研究已获得国家863计划立项资助。沈阳农业大学从土壤中分离到1株对番茄叶霉病有很好作用的抗生素——凯地菌素产生菌,编号为SY20-4,目前正在研究中。2抗真菌育种中抗生素的有效成分研究2.1国外抗真菌工农业抗旱抗生素的有效结论的研究2.1.1色产色链霉菌灭瘟素BlasticidinS是第一个成功应用于农业的核苷类抗生素。1958年,Takeuchi等从灰色产色链霉菌(Streotomycesgriseochromogenes)中成功将其分离。1959年,Misato等发现BlasticidinS对稻瘟病有很好的抑制作用。其结构见图1。除了BlasticidinS外,从同一菌株中又分离到了BlasticidinA,B,和C,但是在实际应用中,它们没有抑菌效果。2.1.2美多酚2.1.3基于iha.aseonus的水稻纹枯病防治多氧霉素(Polyoxins)是一种肽嘧啶核苷类抗生素,它是日本的Klsono等从可可链霉菌阿苏变种(S.cacaoivar.asoensis)中分离得到的代谢产物,对水稻纹枯病及其他真菌病害有良好的防治效果。多氧霉素主要成分包括A-M13种组分,结构见图3,由于结构式中的R1、R2、R3不同而有多种结构,其中,有效组分为B组分。KiyoshiIsono等分别采用活性炭、Dowex50W离子交换树脂、SE-Sephadex、纤维素色谱法等分离得到了A、B组分。2.1.4土壤大素pa的活性成分有效霉素(Validmycin)是由日本武田制药公司筛选抗水稻纹枯病抗菌素时找到的一个新品种。该药1966年由日本兵库县明石市土壤中分离的吸水链霉菌柠檬变种(Str.hygroscopicusvar.limoneus)所产生,对水稻纹枯病有良好的抑制效果。有效霉素的化学成分包括有效霉素A、B、C、D、E、F,和有效氧胺(Validoxylamine)A和B。随后,又发现了有效霉素G、H2个组分。其中,用于防治病害的主要是A组分。其结构见图4。2.1.5小银行酶pa的基因型菌株春雷霉素(Kasugamycin)又称春日霉素,是于1963年4月从日本奈良县春日神社境内的土壤中分离得到的一种放线菌所产生的氨基糖苷类抗菌素,其产生菌为小金色链霉菌(SterptomycesKasugaensis)。其结构见图5。春雷霉素对稻瘟病菌有强烈的抑制作用。2.2抗真菌育种中的抗真菌有效成分的研究2.2.1石蜡2.2.2农抗400外因子类抗菌素农抗120(Agriculturalantibiotic120)是刺孢吸水链霉菌北京变种(Streptomyceshygrospinosusvarbeijingensis)产生的代谢产物。该菌于1957年由中国农科院土肥所刘守初等在中国农科院实验农场分离得到。中国农科院生防室进行了该杭生素的开发研究,并对其理化性质、组分、作用机理和诱变育种作了一系列的研究。农抗120是嘧啶核苷类抗菌素,其主要组分为120-B,类似下里霉素(Harimycan),次要组分120-A和120-C,类似潮霉素B(Hy-gronycanB)和星霉素(Asteromycin)。江爱兵分别用碱性氧化铝、硅胶G、711离子交换树脂、732离子交换树脂、H101离子交换树脂、微晶纤维素制成层析柱,水饱和的正丁醉作为流动相调pH值4、9分别进行柱层析,最后选取硅胶GF薄层层析得到I、Ⅱ号素2个具有很强的抑制真菌能力的活性物质。2.2.3尼可口及其衍生物尼可霉素(Nikkomycin)首先是由德国的Zähner等从唐德链霉菌的发酵液中分离的。中国是由中国科学院微生物研究所从东北土壤中分离到的圈卷产色链霉菌7100是尼可霉素的良好产生菌。尼可霉素是一类两性水溶性核苷肽类抗生素,到目前为止已从野生株及突变株的发酵液中分离到20多种活性单组分,其中研究较多的活性组分为X和Z,两者均为别呋喃糖醛酸的衍生物,尼可霉素X和Z均是由链霉菌属(Streptomycestendae)的发酵液中分离出来的,化学结构见图7。尼可霉素在生物合成基因研究方面取得了很大的进展,但是在分离提取等下游技术方面的报道不多。汪志鑫采用离子交换法和减压浓缩法对尼可霉素的分离提取工艺进行了研究。2.2.4万隆素2.2.5植物界elisa/外部材料武夷菌素是中国农业科学院植物保护研究所1979年从福建省武夷山区采集的1株链霉菌——不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)分离的1种核苷类抗生素,又称农抗Bo-10。对植物真菌性病害具有广谱性和特异性,尤其对蔬菜真菌病害防效突出。武夷菌素为水溶性物质,目前已分离出A、B2个组分。其主要活性组分A为1种结构全新的、具有1含过氧键侧链的氮取代胞苷骨架的核苷类抗生素,具有中国自主知识产权,但其侧链有过多的双氧键,稳定性还有待待进一步研究确定。初步确定的结构见图9。2.2.6菌株组成、结构中生菌素(Zhongshengmycin)是中国农业科学院生物防治研究所研制成功的一种新型生物农药杀菌剂,产生菌属于淡紫色灰链霉菌海南变种(Streptomyceslavendulaevar.hainanensisn.var.)。中生菌素的主要组分为N-糖苷类碱性水溶性物质,属于链丝菌素族抗生素的一员,其结构包括一分子古洛糖胺,一分子链里定和由1-7分子β-赖氨酸组成的肽链。结构见图10。3结构的优化设计及筛选随着人们环保意识的增强,一些不易降解的化学农药已经禁止使用,如DDT、六六粉等,各主要发达国家均陆续公布了禁用化学农药名单并制定了生物农药(包括农用抗生素)的发展规划。随着生物农药尤其是农用抗生素的广泛应用,人们逐渐认识到农用抗生素作为活性化学物质,也同样具有安全性及和环境的相容性问题。因此,研究农用抗生素的有效成分,从其化学结构角度进行讨论,对新农用抗生素的研究与开发将起到指导性的作用。从大的方面来说,农用抗生素的研究主要是上游过程的研究和下游过程的研究。上游过程中,除了继续筛选新的农用抗生素,通过传统的物理化学等方法对产生菌进行诱变,筛选效价更高的菌株外,还应该利用分子生物学等方法,在基因水平对产生菌有针对性的进行改造,提高产生菌的发酵水平,降低生产成本。下游过程是为上游过程服务的,在农用抗生素整个研究中尤为重要。在下游过程中,农用抗生素的分离纯化技术及有效成分的结构鉴定是关键环节,直接关系到农用抗生素能否符合质量标准并且产业化进入市场。在鉴定结构以后,可以利用化学手段,对农用抗生素的结构进行修饰和改造,从而筛选效价更高的衍生物;为农用抗生素菌种诱变选育及利用分子生物学技术对菌种进行改造提供检测的依据;为明确农用抗生素的作用机理提供物质基础;人们还可以利用已知农用抗生素的结构为前体,按照人们的意愿合成药效更好、对环境影响更小的生物农药。所以,在以后农用抗生素的研究工作中,无论是新开发的还是已经商品化的都要加强研究、生产、应用过程中的基础研究,尤其是有效成分的研究,提高农用抗生素的整体水平,增强农副产品的国际竞争力。米多霉素(Mildiomycin)是由放线菌科链霉菌属的龟裂链轮丝菌(StreptoverticilliumrimofaciensB-98891)产生的一种水溶性核苷类代谢产物,结构见图2。其产生菌是SetsuoHarada等从日本的PapuaNewGuinea地区的土壤中分离得到的。米多霉素对白粉病菌等粉状霉菌有很强的抑制作用。日本学者Suita等探索性的摸索了一条米多霉素的提取方法,但是该流程繁琐且成本较高,所以就限制了其在实际中的应用。YongChen等根据其结构特性,选用弱酸性HZ110TM型离子交换树脂,对米多霉素在HZ110TM树脂上的的分离提取工艺进行了研究,实现了米多霉素的高收率、高纯度的分离纯化。井冈霉素(Jinggangmycin)是1972年上海农药所在中国井冈山地区土壤中发现的吸水链霉菌井冈变种(S.hygroscopicusvar.jinggangensisyen)产生的一种氨基糖苷类代谢产物,对水稻纹枯病有良好的的防治作用。经组分测定,井冈霉素化学成分为A、B、C、D、E、F6个组分,后来又报道了G和H2个组分,其中,有效成分为井冈霉素A,与日本的有效霉素A的结构相似,其结构见图6。自井冈霉素生产以来,文献中先后报道了5种提取方法,其中以离子交换法的分离提取效果最好。上海农药所用凝胶型离子交换法对井冈霉素进行了分离提取。郑裕国等通过对树脂类型、上柱流速、洗脱剂等条件的筛选,摸索了离子交换法提取井冈霉素的提取工艺路线,得到了化学效价900u/mg的井冈霉素粉剂,为井冈霉素降低生产成本,获得较高的经济效益提供了理论基础。杨志钧等用大孔离子交换树脂对井冈霉素进行了研究,发现大孔强酸性树脂比凝胶强酸性树脂交换容量大