刺五加皂甙对青霉素致痫大鼠海马长时程增强的影响

刺五加皂甙对青霉素致痫大鼠海马长时程增强的影响

癫痫的出现与细胞外液钾离子浓度异常增加和大量钙离子内流密切相关，并常伴有学习记忆能力的下降。刺五加皂甙(acantbepanaxsenticsussaponin,ASS)具有阻止钙离子通道、清除自由基等药理活性,对脑有保护作用,并且对大鼠海马脑片长时程增强(LTP)有明显促进作用,而ASS对青霉素致痫大鼠海马LTP的影响未见报道。海马的LTP是突触水平研究学习和记忆的模型,故实验研究ASS对青霉素致痫大鼠海马LTP的影响,为改善癫痫特别是青霉素脑病患者认知能力提供理论依据。1材料和方法1.1ass海水淡化注射用青霉素钠(批号:08019579,华北制药厂生产);ASS(由吉林大学有机化学教研室提取,淡黄色粉末状);氨基甲酸乙酯(批号:20080414,国药集团化学试剂有限公司)。1.2立体定向器多道生理信号采集处理系统RM6240B型(成都仪器厂生产);江湾I-C型立体定向器(第二军医大学器材处生产);绝缘双极同芯电极(自制,尖端直径0.1mm,阻抗0.5～1.0M);不锈钢注射套管(内径0.5mm)。1.3实验动物及密度雄性Sprague-Dawley大鼠45只[武汉大学实验动物中心提供,动物许可证号:SCXK(鄂)2008-2009],体质量200～250g,SPF级。1.4侧脑室注射按随机区组设计,以体质量相近原则每组5只。各组大鼠体质量差异无统计学意义(P>0.05);非NS对照组大鼠癫痫发作级别即行为学差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。通过不锈钢注射套管内的硅胶管,侧脑室微量注射不同剂量药物或生理盐水,2min内缓慢注射完毕。非NS对照组腹腔注射(500±50)万U/kg青霉素(8.00×105U/ml)诱发大鼠癫痫,24h后ASS小剂量组(6.25μg/ml,5μl)、ASS中剂量组(25μg/ml,5μl)和ASS大剂量组(100μg/ml,5μl)行侧脑室注射;ASS小剂量组(25mg/kg)、ASS大剂量组(100mg/kg)行腹腔注射,模型组同样途径注射同体积的生理盐水,NS对照组也均以同体积的生理盐水代替。1.5记录小鼠癫痫的程度给青霉素后1h内连续观察大鼠的行为学改变,依据Racine标准分为0～Ⅴ级。1.6legrano大鼠脑定位图谱腹腔注射10%乌拉坦(1ml/kg)麻醉后行常规气管插管,将大鼠头部固定在立体定向仪上,暴露颅骨,确定冠矢交点,标记CA1、CA3大致位置,打开标记范围颅骨,去除硬脑膜,38℃液体石蜡油保护脑组织。动物体温维持在38℃左右。根据Pellegrino大鼠脑定位图谱,将记录电极放置在CA1区(P4.0,L2.4,H2.6),刺激电极放置于CA3区(P3.0,L2.8,H3.6),侧脑室注射的位置为(P0.8,L1.4,H3.6)。信号输入生物信号处理系统,进行记录、分析和储存,电脑同步监视。在CA3区给以单刺激(0.6～1.2mA,调至引起场电位最大振幅的50%左右,波宽1ms,20次/20min);20min后给予条件刺激(强度同前,波宽1ms,波间隔10ms,脉冲数50,4串/6s),5min后开始以同样方式再施以单刺激,继续观察120min左右,并记录CA1区群峰电位(Populationspike,PS)。实验结束后电极通电,灼烧插入点,然后用生理盐水和10%甲醛溶液左心室灌流取脑(普鲁蓝法定位)。1.7统计学分析方法采用SPSS11.5统计软件进行分析,计量资料以x¯±sx¯±s表示,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1ass浓度对ps幅度的影响单个刺激后产生场电位(0.206±0.161)mV,条件刺激后NS对照组PS幅度显著增高,从35min开始PS幅度大于130%一直持续到实验结束;条件刺激后模型对照组PS幅度显著降低,范围为46%～80%,持续2h以上。ASS小剂量组从条件刺激后5min开始PS幅度增大,90min后幅度大于130%一直持续到实验结束;中剂量组从5min后PS幅度增大,25min后幅度大于160%一直持续到实验结束;大剂量组从40min开始PS幅度大于100%一直持续到实验结束。ASS小﹑中﹑大剂量组条件刺激后每15分钟统计的PS幅度均大于模型组;ASS中剂量组条件刺激后PS幅度比ASS小﹑大剂量组都大(P<0.01);ASS小﹑大剂量组条件刺激后PS幅度之间的差异无统计学意义(P>0.05),可见ASS改善了青霉素模型组对PS的抑制作用。见表1、图1。2.2ass小剂量对实验开始ps的影响单个刺激后产生场电位(0.171±0.133)mV,条件刺激后NS对照组PS幅度显著增高,从10min开始PS幅度大于130%一直持续到实验结束;条件刺激后模型对照组PS幅度显著降低,为35.34%～59.16%。ASS小剂量组条件刺激后PS幅度为70.33%～98.68%,大剂量组为83.1%～102.74%,均显著高于模型对照组(P<0.01)ASS小、大剂量组无明显差异(P>0.05)。见表2、图2。3ass改善了癫痫大鼠的ps从Bliss首次描述长时程增强现象(LTP)、单个细胞研究,到如今的神经元网络编码表达模型都表明:虽然海马细胞兴奋依赖的突触可塑性在理论上使人佩服的同时不易用实践证明,但海马LTP已成为反映神经元学习记忆过程的一个重要的客观指标,LTP表现为条件刺激后PS幅度,幅度越大则神经元越活跃,整个海马结构发挥的记忆功效也越强。侧脑室注射ASS后对青霉素致痫大鼠的PS抑制有明显的改善效果,且小﹑中剂量有量效关系,但大剂量的作用低于中剂量。已知痫样放电与细胞外液钾离子浓度异常增高及大量钙离子内流有密切关系,而ASS可以阻止钙离子通道,清除自由基、提高脑内SOD活性的作用,故推测ASS对PS幅度的改善与阻止钙离子通道等有关,但其大剂量作用低于中剂量的具体机制仍需进一步研究。腹腔注射实验的结果也显示腹腔注射ASS对青霉素致痫大鼠的PS抑制有改善效果,但两个剂量间无剂量反应关系。这种无差异可能是因为ASS经腹腔注射透过血脑屏障需要更长的时间,或其透过的量存在一个最大值,且这个最大值在25mg/kg之下,以上推论尚待进一步验证。本实验提示青霉素致痫后大鼠海马LTP转变