髓鞘相关糖蛋白的功能研究进展

髓鞘相关糖蛋白的功能研究进展

神经系统通过髓内鞘的电隔离作用，以快速释放神经脉冲。髓鞘的形成步骤烦琐,需要轴突和髓鞘形成细胞——少突胶质细胞(中枢神经系统,CNS)和施万细胞(外周神经系统,PNS)之间复杂的相互作用。目前得到证实的一种能介导神经元和神经胶质相互作用,参与形成致密髓鞘的分子就是髓鞘相关糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein,MAG)。一、细胞外结构域与小体胞浆的联合MAG是CNS和PNS中的一种髓鞘成分,分别占CNS和PNS髓鞘蛋白的1%和0.1%。它是一种跨膜糖蛋白,分子量约为100kD。MAG是免疫球蛋白超家族成员之一,该家族的众多成员都能促进CNS或PNS的神经元突起生长。MAG又称siglec-4a,siglec是指免疫球蛋白超家族中唾液酸结合蛋白中的一个亚类,它们带有一个特征性的细胞外结构域,即氨基末端的V型免疫球蛋白(Ig)结构域和紧邻的C2型Ig结构域,该类分子大多在免疫系统或神经系统中发挥重要作用。MAG转录时经不同剪接可产生67kD(S型)和72kD(L型)两个异构体,二者胞外区和跨膜区相同,但胞浆区的长度不同。啮齿类动物中L-MAG的表达峰值出现在发育早期,然后逐渐减少,主要富含于发育过程中的CNS,而S-MAG则是成年CNS和PNS中MAG的主要异构体形式,此时在PNS中L-MAG已基本消失。同时研究还发现只有L-MAG能激活胞浆的非受体酪氨酸激酶Fyn,而这正是神经系统髓鞘化信号转导中的关键一步。因此推测L-MAG特有的胞浆部分对于CNS中髓鞘的形成至关重要,而S-MAG则主要用来维持PNS髓鞘的完整性。免疫组化研究结果表明,MAG定位于少突细胞和施万细胞的表面,在轴突形成髓鞘的起始阶段就可检测到。在髓鞘化的轴突中,它定位于髓鞘膜的最里层,直接和轴突相接触。MAG在髓鞘和轴突界面的特殊定位以及它在发育中的早期表达,提示该分子可能介导了轴突与胶质细胞间的早期相互作用,参与髓鞘化的启动及髓鞘化轴突与胶质突起之间稳定连接的维持。二mag和神经系统髓鞘形成和维护(一)背根神经节系统mag的表达体外实验证实MAG介导了神经细胞与形成髓鞘的胶质细胞间的相互作用。人为降低施万细胞中MAG的表达,则共培养的背根神经节(DRG)的髓鞘化受损;而上调其表达,DRG的髓鞘化启动则加速。同时MAG还能增强少突细胞的存活,促进其与神经细胞间的粘着及髓鞘膜的形成,而对少突前体细胞分化成熟的比例则影响不大。(二)评分小鼠视网膜电泳分析MAG是髓鞘化过程中最早表达的蛋白之一,根据其细胞定位推测它可能参与髓鞘化的启动,而对MAG缺陷鼠的髓鞘形成及形态的观察进一步证实了这种推测。如年幼的MAG缺陷鼠,其视神经的致密髓鞘形成明显延迟,与同龄野生鼠相比,其视网膜神经节细胞被致密髓鞘包绕的密度减少了50%;而成年缺陷鼠则呈现明显低髓鞘化,其视神经中带有众多无髓鞘和长度较短的轴突;但该鼠外周神经的髓鞘化速度却与野生鼠相似,故推测MAG参与了CNS而不是PNS的髓鞘化启动。(三)成年以及老年mag缺陷鼠的超微结构改变电镜结果显示:MAG缺陷鼠中,致密髓鞘的超微结构不受影响,如在CNS或PNS的轴突旁区,即分隔髓鞘和轴突的狭窄间隙,其构成基本正常,但某些髓鞘化的轴突有扩大的轴突旁间隙,其CNS髓鞘的轴突旁有异常细胞浆环的形成。而在成年以及老年MAG缺陷鼠中则发现PNS的髓鞘有明显退行性改变,出现所谓的“洋葱”细胞,即大的轴突周围包绕着一圈小细胞,这是未成熟的施万细胞的一种表现型,它们对轴突产生机械压迫作用,干扰了轴突的运输,最终导致轴突的退化。同时MAG对于髓鞘化轴突的管径有正向调节作用,缺陷鼠的PNS中被髓鞘包绕的轴突管径明显减小,这可能与神经微丝间距减小及神经微丝磷酸化有关,提示髓鞘基因的突变可能会导致神经细胞继发有害的改变。此外,成年MAG缺陷鼠的超微结构还发现少突细胞的突起远端明显营养不良,而近端突起及胞体的形态则保持完整。这种少突细胞的病变常见于包括多发性硬化症在内的毒性或免疫介导的脱髓鞘疾病,其发病的分子机制以及同MAG基因缺陷之间的联系尚不清楚。(四)mag/fyn的信号转导通路动非受体型酪氨酸激酶Fyn是Src家族中的一员,它是MAG的下游信号分子,在髓鞘化启动中发挥关键作用。研究发现成年Fyn缺陷鼠的CNS中出现明显的低髓鞘化,其视神经中有大量未髓鞘化的小的视神经节细胞轴突,而CNS的低髓鞘化比MAG缺陷鼠还严重。这表明在CNS髓鞘化的启动中,MAG/Fyn的信号转导通路意义重大。同时该通路又是复杂的,二者都可能通过其它替代通路启动髓鞘化,因此,在MAG/Fyn双重突变鼠的神经系统中,低髓鞘化现象要比两者的单独突变体都严重。(五)mag的功能如上所述,MAG参与髓鞘化的启动及完整髓鞘的维持,但观察发现MAG缺陷鼠的功能障碍并不突出,其CNS中不少髓鞘的形态都是完整的,PNS的髓鞘形成也是正常的。这表明MAG并不是髓鞘化中唯一必需的分子,在缺陷体中还存在功能相似的其他分子,它们可以在一定程度上弥补MAG的缺陷,如神经粘附分子NCAM和L1等。换句话说,当MAG存在时它可启动髓鞘化,当它缺少时,其他分子可替代MAG的功能。转基因鼠为MAG在髓鞘形成及其维持中所起的作用提供了大量证据,结合体外的细胞实验结果,研究者推测,MAG可能充当一种受体,它将信号转入形成髓鞘的胶质细胞,并促进其与轴突的相互作用,完成髓鞘化的启动和髓鞘的长期维持。此外,MAG还有一个重要作用,即限制轴突的再生。三、mag和神经系统的轴突生长(一)mag的体内功能Shwab等(1993)最早发现在CNS中有潜在的生长抑制活动,并指出这种抑制与髓鞘有关,而MAG即是第一个被鉴定出的具有轴突再生抑制作用的髓鞘蛋白。通过DEAE柱层析法,从CNS髓鞘中分离得到的可溶性髓鞘蛋白——MAG可以明显抑制突起的生长,引起生长锥的塌陷,抑制包括神经节细胞在内的多种神经元突起的生长;通过免疫耗竭法除去MAG后,可明显减少髓鞘对轴突生长的抑制作用。但体内功能研究发现,MAG缺陷鼠中CNS髓鞘的抑制活动并没有显著减少,CNS损伤后其轴突再生只轻微改善或根本没有变化,这可能源于其他抑制分子的代偿。Wong等在视神经受损后用激光急性选择性地灭活MAG分子,发现有大量的视网膜轴突再生,并通过了含有CNS髓鞘的损伤部位,因此推断MAG是髓鞘来源的神经抑制分子的主要成分。(二)drg神经元对mag的表达在MAG之后又陆续鉴定出Nogo和OMGP两种髓鞘来源的生长抑制蛋白,相比之下,MAG受关注的程度远不如Nogo,其关键在于研究人员对MAG的生长抑制活动存在争议。先前报道MAG是有利于轴突生长的细胞粘附分子(Johnson等.1989),这与后来发现的抑制作用相矛盾。目前已弄清楚,此源于MAG的双功能性,以及不同发育阶段的神经元对MAG的反应性不同。据报道,出生4天以上的DRG神经元与表达MAG的细胞共培养时,突起延长减少约50%,而与小于4天的神经元共培养时反而促进突起的生长,这说明在胚胎发育的早期阶段,虽然MAG和它的受体都已存在,但不阻碍轴突生长,因为神经元只有在发育的较晚阶段才对它敏感,此时往往伴有神经元内源性cAMP水平的降低。人为增加成年神经元中cAMP水平可以克服MAG对轴突生长的抑制作用,将其与表达MAG的细胞共培养时,其轴突反被诱导生长(Vinson等.1998)。(三)抗fu-pag-g1a、gt1b以及对ngr1a的抑制剂MAG的抑制功能被证明后,其受体的鉴定同样一波三折。MAG是siglec的成员,可以和唾液酸结合。研究发现用神经氨酸酶去除神经元表面的唾液酸可阻断MAG对神经元突起生长的抑制作用,并证明带有唾液酸的神经节苷酯GD1a和GT1b作为神经元的受体介导了MAG的抑制作用,而可溶性的GD1a、GT1b以及针对GD1a的抗体可以明显减少MAG所介导的神经元生长的抑制作用(Vyas等.2002)。然而令人吃惊的是,后来发现MAG可以特异地、并以高亲和力与Nogo的受体NgR结合,通过三种髓鞘抑制分子共同的信号转导途径,引发对神经元突起生长的抑制。NgR是富含亮氨酸重复序列(LRR)的膜蛋白,通过GPI固定于浆膜的外层,一旦将GPI连接蛋白从轴突上剪切去除,就可以保护生长锥免于MAG诱导的塌陷。而抗NgR抗体和可溶性的NgR都能阻止MAG对突起生长的抑制,甚至原本对MAG抵制的胚胎神经元,在表达NgR后也会对MAG的抑制作用敏感,而最近证实是NgR家族中的NgR2选择性介导了MAG的抑制效应。由于NgR介导了三种髓鞘蛋白的抑制作用,因而成为CNS受损后一种很有希望的促进再生的治疗靶点。(四)信号转导途径随着研究的不断深入,研究人员发现神经营养因子受体p75NTR在转导MAG的抑制效应中起到共受体的作用,它与NgR、GT1b等一起构成神经元细胞膜表面的脂质阀受体复合物,共同参与MAG所介导的下游抑制信号的传递(Vinson等.2003),并证实p75NTR缺陷鼠的神经元对MAG的抑制不敏感,但也发现抑制p75NTR并不能促进受损脊髓神经元的再生,故推测它不是髓鞘抑制中的关键成分。最近Domeniconi等发现MAG通过所谓的RIP(受控的膜内蛋白水解作用),先后经α和γ-分泌酶两次对p75NTR进行剪切,使之释放出25kD的胞内区(ICD),后者正是蛋白激酶PKC和小GTP酶Rho激活所必需的,由此启动下游信号途径来抑制轴突的生长。因此阻断该分泌酶的活性有可能阻断NgR受体复合物与MAG结合所导致的轴突生长抑制,为CNS损伤后的治疗性干预提供了另一有效靶点。近年来,研究还发现神经元内Rho失活或cAMP水平升高,MAG介导的抑制作用会被阻断,因此认为Rho和cAMP参与的信号转导途径也是MAG发挥抑制作用所必需的,二者的作用与MAG介导的抑制效应相一致。推测可能是因为胞内的cAMP升高激活了蛋白激酶A,进而使Rho去磷酸化而失活,阻断了Rho介导的生长锥的塌陷,从而阻断了MAG的抑制作用。由于Rho是多种抑制分子和受体介导抑制作用的汇聚途径,因而也成为CNS损伤后轴突再生和功能康复的重要药物和治疗靶点。MAG作为一种重要的髓鞘来源的神经生长抑制分子,在中枢和外周髓鞘中都有表达,但研究人员很早就发现中枢神经受损后不能再生,而外周神经损伤后能够再生,那么MAG对外周神经再生难道没有抑制作用吗?根据现有的研究结果,目前可能的解释是:首先,MAG在CNS中的含量是PNS的10倍;其次,中枢和外周神经元对MAG的反应可能存在差异;再者,外周神经损伤后髓鞘碎片能快速有效清除,致使MAG的抑制作用来不及发挥,而中枢神经损伤后髓鞘碎片的清除却极其缓慢;此外,二者损伤后局部微环境的介质变化不尽相同,在外周可能有些介质中