苜蓿根际溶磷菌和根瘤菌接种剂的筛选与应用

苜蓿根际溶磷菌和根瘤菌接种剂的筛选与应用

植物根际的有益微生物是指生活在土壤中或植物根际附近的生物，能够促进植物生长。植物可以通过固定空气中的氮（即生物固氮）或溶解土壤中不能直接吸收的磷（即生物溶磷）而刺激植物生长，增强植物吸收矿物和水分的能力，促进植物生长。一些植物还有效地抑制了土壤侵蚀的繁殖和传播。目前,关于有益微生物分离、筛选以及生理生化特性、分子生物学特性和鉴定方面的研究已经较为深入,研究热点逐步集中于利用有益微生物制作的生物接种剂或生物菌肥对作物增产、品质改善以及病害防治方面。郜春花等研究表明解磷菌剂可促进玉米(Zeamays)株高、鲜重和干重增加15.2%~89.2%;青菜鲜重、干重和生物量增加15.8%~41.6%。易艳梅等研究发现溶磷菌EnHy-401在盐碱土壤的良好定殖有助于小麦(Triticumaestivum)生长以及对矿质元素的吸收,其中对P,Ca,K,Mg等矿质元素的吸收率分别提高了34.4%,36.3%,31.5%和6.3%。荣良燕等研究发现促生菌LHS11对黄瓜枯萎菌(Fusariumoxysporiumf.sp.cucumerinum)及西瓜尖镰孢菌(Fusariumoxysporumf.niveum)抑制效果达80%以上,具有较好的应用潜力。因此,利用有益菌研制的接种剂是集促生、防病于一体的“环境友好型”接种剂,是发展绿色食品和生态农业的理想肥料。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)在我国己有2000多年的栽培历史,既可为家畜提供优质蛋白饲料,又能通过固氮过程改良土壤,培肥地力,是我国西北干旱、半干旱地区人工草地的主要牧草之一。研究表明,接种外源苜蓿根瘤菌是提高苜蓿产量、培肥地力的有效措施。而Sigleton等的研究认为一旦土壤中土著根瘤菌的数量达到一定阈值时,接种根瘤菌并不能产生较大的作用。丁武等引入“土壤载菌量”概念研究根瘤菌数量对竞争结瘤的影响,结果表明土壤具有确定的载菌量,接种量高于土壤载菌量时,接种菌数量不仅不上升,反而部分菌会死亡。因此,单一接种根瘤菌可能对苜蓿的结瘤过程产生抑制作用。我国土壤中有95%以上的磷元素不能被植物直接利用,而苜蓿的结瘤和固氮离不开磷素。王富民等研究表明,磷细菌和固氮菌联合生长时,对发挥磷细菌的解磷作用十分有利,有助于土壤中水溶性磷的形成。韩光等研究表明在苜蓿上接种溶磷菌和根瘤菌不仅可以培肥地力,还能显著提高苜蓿产量。因此,有关溶磷菌与根瘤菌互作效应的研究具有重要的意义。本研究利用前期从牧草和作物根际筛选的优良溶磷菌与根瘤菌制作苜蓿根际新型专用接种剂,研究其对苜蓿生长的影响,并筛选出适用于苜蓿的单一及复合菌种接种剂,为苜蓿无公害生产、减少化肥投入量及微生物资源定向利用提供依据和支撑。1材料和方法1.1高原中部降水试验在甘肃农业大学兰州牧草试验站进行(N36.03°,E103.53°),位于兰州市西北部,地处黄土高原西端,平均海拔1525m,年降水量200~320mm,降雨量主要集中在夏季。供试土壤肥力均匀,土壤类型为黄绵土,黄土层较薄,土壤有机质含量0.84%,pH7.28,土壤含盐量0.247%,有效氮95.05mg·kg-1,有效磷(P2O5)7.32mg·kg-1,有效钾(K2O)182.80mg·kg-1。1.2草业科技有限公司选用紫花苜蓿品种阿尔冈金,从甘肃创绿草业科技有限公司购得。供试菌种由甘肃农业大学草业学院草地生物多样性实验室提供,具有较强的固氮和溶磷能力(表1)。1.3测试方法1.3.1菌株的制备及接种将LB培养基生长72h的供试菌株分别接种于100mLLB液体培养基中,置于28℃,125r·min-1的摇床培养3~5d,测定OD660值,确保OD660值大于0.5,并用无菌水调节OD660值一致(使菌数量处同一水平),制成菌悬液,按表2所示处理进行菌株单独或混合施用(注:菌株不论是单独还是混合,接种总体积要相等,混合菌株体积比均为1∶1或1∶1∶1或1∶1∶1∶1),保存备用。1.3.2菌悬液的制备选用泥炭为载体,pH值调节至6.5~7.0。将该混合体按50g每瓶分装,每处理3次重复,在121℃下连续灭菌1h备用;将灭菌后的泥炭载体分别倒入无菌自封袋中,用无菌吸管吸取1.3.1制作的各菌悬液5mL接种到自封袋中立即封口,将菌液与载体充分混匀,用灭菌针在自封袋的中央扎几个小孔,扎孔后的自封袋再外套一自封袋,并在外层自封袋的四周扎几个小孔,一切操作均在无菌条件下进行。将做好的菌肥置于28~30℃下培养7~10d,之后常温保存。1.3.3接种剂及化肥用量试验采用随机区组设计,共设11个处理,每处理3次重复(表2)。小区面积2m×5m,阿尔刚金种子用量为15kg·hm-2,条播,埂宽30cm,行距30cm。接种剂用量为7.5kg·hm-2,用于拌种。化肥用量:全量磷肥用量为300kg·hm-2(当地常用施肥量),半量磷肥用量为150kg·hm-2,磷肥(过磷酸钙,P2O5≥14%)作为基肥施用。苜蓿各生育期内不追肥,同时根据自然降雨及视当地干旱情况,以水分状况满足苜蓿生长为宜,进行田间常规灌溉。1.3.4苜蓿植株叶绿素的测定有效活菌数:稀释平板法;苜蓿高度:于2010年分别测定不同处理下苜蓿植株的自然高度,每样地随机取30株,取其平均值;叶绿素含量:现蕾期每区每处理取植株上部完全展开的新鲜叶片,用乙醇-丙酮法测定叶绿素;干鲜比:初花期每处理刈割鲜样1m2,置于室温下风干,称样品干重,计算干鲜比;叶茎比:现蕾期每处理随机刈割1m2苜蓿植株,将植株叶茎分开,清洗,105℃杀青20min,80℃烘干至恒重后于干燥器冷却,称重;干草产量:每茬草产量的测定均在初花期进行,每处理随机取1m2进行刈割,留茬高度5cm,刈割后晒干称重,并换算成每公顷的干草产量。1.4处理数据采用Excel2007与SPSS13.0进行数据处理与分析,用LSD法进行多重比较。2结果与分析2.1接种剂有效活菌数测定有效活菌数和是否被杂菌污染是表征接种剂质量的一项重要指标。各接种剂质量检测结果表明,单一菌种制作的接种剂(单一接种剂,下同)及复合菌种制作的接种剂(复合接种剂,下同)储存于室温下经30,60,90,120,150,180d,其有效活菌数均在108个·g-1以上,无污染,符合《微生物肥料》N/Y227-94标准。贮存时间延长至270d,各接种剂处理有效活菌均在108个·g-1以下,且伴有轻度污染和霉变现象,此后有效活菌数迅速下降至102个·g-1,霉变加剧。因此建议各接种剂在6个月内使用,以确保肥效的发挥。6个月有效利用期内,复合接种剂有效活菌数较单一接种剂高,复合接种剂有效活菌数也因菌种不同而不同。如I接种剂与J接种剂在各储存时段有效活菌数高于G接种剂而低于F接种剂与H接种剂。2.2嫁接剂对三叶草生长的影响2.2.1复合接种剂用量由图1可知,与A处理(全量磷肥,CK,下同)相比,各接种剂对苜蓿的株高影响各异。复合接种剂的效果优于单一接种剂和CK,单一接种剂不及CK。复合接种剂中除G处理外,其余均较CK的株高增加2.17%~9.00%(第1茬)和1.01%~8.26%(第2茬)。第1茬处理I,J与处理G,H之间差异显著(P<0.05),第2茬处理G与处理H,I,J差异显著(P<0.05),其余复合接种剂处理间差异不显著;单一接种剂处理与CK相比,苜蓿株高有不同程度的下降,且第2茬的下降幅度更为明显,分别为3.52%~8.93%(第1茬)和5.96%~11.18%(第2茬)。单一接种剂处理之间及与CK差异不显著。综上所述,复合接种剂中处理I和J的效果最佳。2.2.2单一接种剂b、c处理由表4可知,苜蓿叶绿素含量因施肥处理的不同差异较大。除D处理外,单一接种剂中B,C,E处理较CK对苜蓿的叶绿素含量影响明显,第1茬增加1.69%~20.34%,第2茬增加1.28%~19.87%,单一接种剂中B处理的效果最佳,E处理次之,D处理的效果最差;复合接种剂处理的苜蓿叶绿素含量较CK分别增加4.52%~51.98%(第1茬)和13.46%~48.08(第2茬),第1茬除F处理外,G,H,I和J处理与CK差异显著(P<0.05),第2茬F,G,H,I和J处理均与CK差异显著(P<0.05)。复合接种剂处理间除I与J差异不显著外,其余各处理间差异显著(P<0.05)。这表明复合接种剂处理提高叶绿素含量效果明显,其中处理I和J的效果最佳。2.2.3茎干鲜比对g处理的影响如表4所示,不同施肥处理下,苜蓿叶茎比和干鲜比变化明显。复合接种剂处理的效果优于单一接种剂处理和CK,但单一接种剂处理不及CK。施用复合接种剂处理,苜蓿叶茎比较CK增加3.45%~13.79%(第1茬)和4.82%~18.07%(第2茬),而干鲜比增加8.90%~19.57%(第1茬)和11.98%~21.07%(第2茬),其中I和J处理的效果最佳,G处理最差;单一接种剂处理对苜蓿叶茎比和干鲜比的影响程度不同,叶茎比较CK下降16.09%~21.84%(第1茬)和13.25%~25.30%(第2茬),而干鲜比第1茬下降2.71%~14.39%,第2茬下降5.45%~14.65%,单一接种剂中处理E的效果较好。2.2.4复合菌肥处理对苜蓿产量的影响干草产量是衡量苜蓿生产能力的重要指标,对苜蓿干草产量的测定结果如表5所示。各施肥处理对苜蓿干草产量的影响显著。复合接种剂的效果优于单一接种剂及CK,单一接种剂处理不及CK。施用复合接种剂对苜蓿干草产量增产幅度可达11.98%(第1茬)和20.95%(第2茬),不同复合菌肥处理对苜蓿产量影响亦不同,如复合菌肥处理G与处理F,H差异显著(P<0.05);单一接种剂中处理E与CK差异不显著,B,C,D处理与CK差异显著(P<0.05)。各施肥处理对苜蓿干草产量的促生效果主要体现在第1茬,处理I和J与其他处理差异显著(P<0.05),且促生效果最佳。苜蓿总干草产量也因菌肥处理的不同而变化明显,最大增幅可达到15.77%。3复合接种剂对玉米产量的影响随着社会对环境保护的日益重视和生态农业的发展,微生物肥料作为新兴的“绿色产业”在农业生产中发挥着越来越重要的作用。微生物肥料又称生物肥料、菌肥、接种剂,是含有特定微生物活体的制品,应用于农业生产,通过其中所含微生物的生命活动,增加植物养分的供应量或促进植物生长,提高产量,改善农产品品质及农业生态环境。由于微生物种类繁多、作用机理多样,体现出多样化的功能,研发与应用的潜力巨大。微生物肥料主要通过活体微生物的数量来体现,其质量由多种因素决定,包括菌种来源、菌剂组成、菌种组合与比例、载体种类与质量,还受土壤生态环境(水分、湿度、通气状况、pH值等)的影响。另外,微生物肥料的施用方法、施用量以及施用时间也因作物不同而有所差异。本研究制作的固体接种剂贮存180d,有效活菌数在2.79×108个·g-1以上,符合《微生物肥料》NY227-94质量标准,接种剂的贮存时间延长至270d,各接种剂处理有效活菌均在108个·g-1以下,且伴有轻度污染和霉变现象,而当保存时间为360d此后有效活菌数迅速下降至102个·g-1,霉变加剧。因此,为了延长各菌肥接种剂的贮存时间,可以尝试在其中加入一定比例的真菌抑菌剂。近年来,各国学者就生物菌肥的应用潜力进行了大量实践,如Mohammad等在PGPR和PSM对玉米产量影响的研究表明,接种的菌肥可以显著提高玉米产量的同时减少50%的磷素供应,但不能补偿缺少氮素对其的影响。孙淑荣等报道接种复合制剂对玉米增产效果显著,玉米平均增产11.01%,增产幅度为7.35%~15.26%,并可替代10%~20%的化肥,减少投入750~1050元·hm-2。本试验结果表明,各施肥处理对紫花苜蓿的株高、叶绿素含量、干鲜比、叶茎比及干草产量具有明显的促生效应,增产效果总体呈现复合接种剂+半量磷肥处理>全量磷肥处理>单一接种剂+半量磷肥处理,这与韩文星等在燕麦(AvenasativaL.)上的研究结果一致。本研究结果表明,单一接种剂的接种效果因菌株个体的差异,表现有所不同,如S7+1/2P处理对苜蓿的各项指标促生效果优于其他单一接种剂处理,除与苜蓿根瘤菌S7固有的特性有关,还可能由于土著苜蓿根瘤菌结瘤能力和固氮能力较低,接种外源苜蓿根瘤菌S7(固氮酶活性为1321.36C2H4nmol·m-1·h-1)可有效改善苜蓿根瘤菌的结瘤和固氮能力,进一步提高苜蓿的产量。施用S7+1/2P处理苜蓿叶绿素含量较全量磷肥处理增加16.95%(第1茬)和10.90%(第2茬),对苜蓿株高、叶茎比、干鲜比以及干草产量的影响不及全量磷肥处理,但与全量磷肥的差异不显著;复合接种剂处理的效果优于全量磷肥处理,以处理I和J的效果最佳,处理G的效果最差。处理J对苜蓿株高、叶绿素含量、叶茎比、干鲜比以及产量分别较全量磷肥增加9.00%,51.98%,13.79%,19.57%,11.98%(第1茬)和8.26%,48.08%,16.87%,20.07%,20.95%(第2茬),这可能与菌株之间的互作效应有关。研究证实,溶磷菌溶解的磷矿粉能作为根瘤菌的磷源,促进其生长繁殖,为植株提供更