氧空位钼基纳米材料构建及其声动力抗深部耐药菌感染研究

氧空位钼基纳米材料构建及其声动力抗深部耐药菌感染研究摘要深部耐药菌感染发病率高、发展快及病死率高，是全球人类死亡的主要诱因之一。声动力治疗（SDT）作为一种活性氧（ROS）依赖的广谱非抗生素杀菌模式，具有无创性、局部刺激和高组织穿透力等优势，在抗深部耐药菌感染方面具有广阔的应用前景。然而，现有声敏剂ROS产率普遍较低且缺乏调控手段，严重限制SDT的深入应用。申请人前期通过调控二硫化钼晶相，初步实现其声致ROS生成。本项目拟构建系列高效MoO3-X声敏剂，实现抗深部耐药菌感染。首先，通过离子插层技术构建氧空位MoO3-X纳米材料，探索其声动力性能；研究其近红外二区光热性能，验证光热提高声敏剂ROS产率；构建深部耐药菌感染模型，评估MoO3-X声敏剂SDT疗效。本项目从“化学-材料学-生物学”相结合的模式全面研究SDT策略，并从“分子-细胞/细菌-动物”多角度对其作用机制深入探讨，为新一代纳米声敏剂的构建提供新策略，为解决深部感染治疗提供新思路。关键词：纳米材料；声动力；耐药菌感染

目录TOC\o"1-3"\h\u20294一、绪论 223640（一）研究背景 22560（二）研究意义 329342（三）研究的主要内容 421365（四）研究目的 521133（五）研究可行性分析 623388（六）本研究的创新点 711740二、国内外细菌感染统计 712802三、抗感染疗法分类 911084（一）非抗生素抗菌策略 91065（二）钼基纳米声敏剂 1027027四、构建缺陷型钼基纳米材料的方法研究 1128350（一）MoO3-X纳米材料的制备与表征 1228343（二）MoO3-X纳米材料光热性能研究 1229013（三）MoO3-X纳米材料声动力性能研究 133854（四）MoO3-X纳米材料生物安全性评估 1332153（五）MoO3-X纳米材料光热增强SDT研究 1329060参考文献 1521256致谢 17绪论（一）研究背景鉴于目前纳米材料在SDT研究领域所面临的关键科学问题和本项目提出的创新思想。结合课题组前期工作基础积累[25]，本项目拟构建氧空位调控MoO3-X的钼基纳米材料，实现其声动力用于深部耐药菌感染的治疗。申请人通过初步预实验探究：以球磨、还原法和水相离子插层技术，对MoO3纳米带进行离子插层反应，成功构建富含氧空位结构，且均匀分散的钼基纳米材料（MoO3-X）。MoO3-X呈现拓展的层间隙、较强的近红外二区光学吸收和较高的光热转换系数，初步验证了MoO3-X纳米体系及其性能之间调控的可行性。本项目的开展将会为钼基纳米材料在增强SDT性能方面提供新的思路，揭示MoO3-X结构工程如何调控光热和SDT性能的分子机制，解决钼基材料声动力效率低的瓶颈，从而获得高性能的MoO3-X纳米材料。通过生物活性检测和代谢行为研究，优选出生物降解性良好并且性能优越的MoO3-X纳米材料，再评估其光热增强SDT在深部耐药菌感染的治疗效果。此外，设计和制备生物可降解型钼基纳米材料，为实现高效的SDT疗法提供理论依据和技术手段。深部耐药菌感染的治疗过程，必须克服感染组织微环境的局限性，如组织穿透能力、感染组织富集及乏氧等。声动力治疗（SDT）作为一种新型的无创感染清除策略，具有组织穿透更深、副作用少、患者依从性好等优点，从而具备临床广泛应用的前景。在SDT中，利用超声激活声敏剂，产生非抗生素依赖的活性氧（ROS），诱导细菌壁的塌陷，对细菌和生物膜造成不可逆的杀伤。传统的有机声敏剂，如卟啉、竹红素等水溶性差、感染组织富集少，限制了SDT的疗效。而无机/有机杂化纳米声敏剂具有良好的体内稳定性、可控的理化性质、易于实现多功能性和高靶向性等特点，极大地拓展了其在SDT中的应用。然而，声敏剂ROS产率较低，严重影响SDT的治疗效果。研究表明，SDT与多种疗法（如化学动力学疗法、光动力疗法和光热疗法等）相结合的模式，已经取得了足够的进展，可以在本质上突破SDT的局限，被认为是一种有希望替代抗生素依赖细菌性感染的疗法。三氧化钼（MoO3）作为一种经典的过渡金属氧化物，具有独特的层状结构，被广泛应用于催化和生物医学领域。研究发现氧空位结构可引起MoO3表面等离子体共振效应，增强其在近红外二区的光学吸收和光热转换效率，使MoO3-X材料展现出优异的近红外二区光热治疗性能。同时，MoO3-X纳米材料中不同价态的钼离子能够在超声驱动下诱导大量ROS的产生，赋予其优异的SDT性能，上述性能使得其在近红外光热增强SDT领域展现出非常好的发展前景。因此，通过对MoO3-X缺陷结构的设计以调控其光热增强SDT，实现高效的SDT抗深部耐药菌感染的治疗。本项目拟通过构建氧空位MoO3-X纳米材料调控其光热、声动力和生物降解性能，实现光热增强声动力抗深部耐药菌感染的治疗，通过“化学-材料学-生物学”多学科的引领并拓展“药学-生物学-医学”等学科前言。（二）研究意义致病菌感染给全球造成严重的经济负担。虽然抗生素在抗击细菌性疾病方面取得了成功，随着抗生素耐药菌株不断增加，尤其是多重耐药（Multi-drugresistant,MDR）菌株，大大降低了抗生素的治疗效果，导致高病死率[1,2]。其中，深部细菌感染为临床常见的病症之一，致病菌入侵皮下组织、黏膜以及内脏等会导致一系列疾病，如败血症，脏器衰竭，甚至死亡。目前，通过口服和静脉注射治疗深部耐药菌感染，但是口服和静脉注射毒副作用大，而且难以避免耐药问题的产生。因此，面临日益严重的细菌耐药性问题，开发高效、低毒、非抗生素依赖的抗菌药物和抗菌策略势在必行。近年来，由于无机/有机杂化纳米体系具备通过诱导氧化应激破坏整个微生物氧化还原系统进而根除细菌病原体的潜力，纳米抗菌技术引起了广泛关注[3,4]。非抗生素治疗模式中，活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）产生对纳米材料的抗菌性能起着至关重要的作用。近年来，光动力疗法（PhotodynamicsTherapy,PDT）、化学动力学疗法（ChemodynamicTherapy,CDT）和声动力疗法（Sonodynamictherapy,SDT）被认为是一种非常有前景对抗MDR细菌感染的替代方案。但是，PDT受组织穿透力的局限，而CDT不可控持续性产生ROS容易引发炎症，限制两种疗法的进一步推广和应用。而SDT通过超声（Ultrasound,US）触发声敏剂产生大量ROS，对各种MDR细菌具有高度的生物毒性，且不存在耐药性问题。此外，SDT模式具备无创性、局部治疗及高的组织穿透能力，使SDT在深部耐药菌感染治疗领域有巨大的优势和潜在的临床转化前景。然而，深部细菌感染组织具有复杂的微环境，如乏氧和低pH等。而在超声触发过程中，氧气（O2）对声敏剂诱导的ROS生成至关重要。因此，细菌感染部位的缺氧微环境将在很大程度上限制SDT效果，而且SDT过程中快速耗氧，会大大加重缺氧现象，进一步降低声敏剂ROS产率[5,6]。因此，如何提高声敏剂SDT的疗效为亟待解决的问题。虽然开发了多功能复合纳米材料，利用复合材料在感染组织中通过携氧等方式提高感染部位氧气含量，可以提高复合材料的SDT性能。但是，由于细菌感染组织微环境的多样性和复杂性，使得单一的SDT治疗模式难以达到预期的治疗效果。因此，本项目开发具有高效SDT性能的无机/有机杂化纳米体系，并利用近红外二区光热增强SDT性能，为纳米药物在声动力应用领域提供新的借鉴和为细菌感染患者治疗寻求新的理论基础。研究的主要内容本项目拟构建含氧空位的MoO3-X纳米材料，以近红外二区光热增强声动力实现深部耐药菌感染的治疗。本项目的研究内容主要包括以下四个部分：1氧空位MoO3-X纳米材料的制备和表征利用水热法制备形貌均一的MoO3纳米带，通过球磨、还原以及水相离子插层技术，将MoO3纳米带快速缩短并转变为层间隙扩展和富含氧空位的MoO3-X纳米材料。此外，通过扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）和电子自旋（顺磁）共振波谱仪（ESR）等设备对MoO3-X纳米材料的微观形貌、纯度、插层结构、钼元素价态以及氧空位结构等方面进行表征与分析。2氧空位MoO3-X纳米材料光热和声动力性能研究采用热成像和近红外紫外光谱（NIR-vis-UV）对MoO3-X纳米材料在近红外二区的光学吸收、光热转换效率以及在不同条件下（如照射时间、照射功率等）的光热性能；通过声动力系统和探针检测技术对MoO3-X纳米材料ROS的产量、类型以及在不同条件下（如超声时间、超声功率等）的声动力性能进行研究；结合光热系统和超声系统检测光热对SDT性能的影响。3氧空位MoO3-X纳米材料生物安全性评估通过细胞毒性（CCK8）评估氧空位MoO3-X纳米材料体外的生物相容性；通过动物血常规和血生化、小鼠体重变化以及主要器官（心、肝、脾、肺和肾）组织学分析评估MoO3-X纳米材料体内的生物安全性；通过监测主要器官和血液中钼金属的含量，分析MoO3-X纳米材料在体内的降解机制和代谢途径。4氧空位MoO3-X纳米材料光热增强声动力抗感染治疗构建小鼠皮下耐药菌感染模型，将MoO3-X纳米材料原位注射进小鼠皮下的感染组织中，结合近红外二区光热和声动力系统对小鼠感染组织进行治疗，通过监测小鼠皮下脓肿消散、细菌数量以及脓肿组织免疫荧光分析等评估MoO3-X纳米材料对活体深部耐药菌感染治疗的疗效。研究目的1通过离子插层技术构建氧空位MoO3-X纳米材料实现高效的SDT性能无机/有机纳米声敏剂ROS产率低是制约SDT的主要原因。如何通过纳米材料的结构工程提升SDT效率是本项目需要解决的最为关键的问题。本项目拟通过水相离子插层技术，利用不同原子半径碱金属离子的插层对MoO3-X分子中氧空位结构进行精准控制，而氧空位结构在超声作用下会加速MoO3-X纳米材料中电子-空穴的分离，进而调控其高效的SDT性能。2通过氧空位结构调控光热增强SDT策略实现高效深部耐药菌感染的治疗深部耐药菌感染治疗是目前临床面临的难题之一，如何实现高效的深部耐药菌感染治疗这是本项目需要解决的又一关键问题。氧空位结构能够提高SDT性能外，还可以激活MoO3-X纳米材料在近红外二区光学吸收，并通过光热性能进一步加强SDT效率，进而实现MoO3-X调控光热增强SDT高效的抗感染治疗。研究可行性分析1、理论可行本项目针对传统的光热增强声动力治疗纳米材料存在生物安全性差、近红外二区光热转换效率低和声动力效率低等方面问题，拟通过水相离子插层技术的优势，用碱金属离子插层诱导氧化钼纳米材料的结构改性，制备生物安全性好、近红外二区光热转换效率高和声动力效率高的氧空位型MoO3-X纳米材料，通过光热增强声动力治疗策略用于深部细菌感染的治疗。申请人前期成功制备了二维缺陷型M-MoS2纳米片，在水相离子插层方面积累了成熟的经验。因此，经机械球磨制备纳米MoO3插层前驱体，再用碱金属离子水相插层合成MoO3-X纳米材料是完全可行的。同时，通过文献报道和申请人的前期研究工作基础（缺陷型M-MoS2具备声动力治疗能力）证明了具有一定氧空位的MoO3-X纳米材料具备潜在的声动力治疗能力和良好的生物安全性。因此，伴随着氧空位的出现，MoO3-X纳米材料声动力治疗和近红外二区光热性能会显著提升。此外，在深部耐药菌感染环境中，声动力和近红外二区光热可有效到达治疗区域，从而提高材料的抗感染治疗。结合近期申请人在近红外光热抗感染治疗方面的研究基础，合理控制激光的功率和辐照时间，实现MoO3-X纳米材料的光热增强声动力治疗策略是完全可行的。2、条件可行在化学、材料学、生物学、药学和医学等领域有良好的基础，视光学和视觉科学国家重点实验室、国家眼视光工程技术中心、国家卫生健康委视光学研究中心等为本项目提供了研究所需的设备支持。申请人所在的眼视光学院具有国家卫生健康委视觉科学研究重点实验室、国家临床重点专科建设单位、国家临床药物试验机构等多个重点研究平台，以上科研与临床平台为项目的顺利进行提供了有力保障。3基础可行于2018年至2019年在香港大学化学系以访问学者身份从事科学研究，期间一直致力于抗菌药物的设计与抗菌机制方面的研究。在材料制备、生物成像、纳米药物递送及抗菌机制等方面积累了一定的研究基础。丰富的研究经历为申请人在多功能纳米材料的设计、制备及生物学应用等方面打下了坚实基础。申请人现在所在的温州医科大学具有良好的实验条件（详见工作条件），有充足的人力和物力保障本项目顺利进行。综上，基于申请人前期的工作基础、生物和化学检测平台的设备条件以及可行的实验方案，这些都为本项目的完成提供了支撑。本研究的创新点本项目针对钼基材料声动力抗深部耐药菌感染的问题，具有以下的特色和创新：（1）构建氧空位MoO3-X纳米材料实现结构与性能之间的精准调控利用离子插层技术诱导MoO3结构工程（氧空位和分子层间隙的调控），从而有调控MoO3-X纳米材料的近红外二区光学吸收、声动力性能和生物相容性，进一步推动了钼基纳米材料在声动力领域的发展。（2）MoO3-X纳米材料调控光热增强SDT实现高效的深部感染治疗通过对深部耐药菌感染组织光热处理进一步提升感染部位声敏剂ROS的产量，大大提高SDT的疗效，为光热增强SDT的钼基纳米材料奠定基础。此外，通过“分子-细胞/细菌-活体”研究思路，为钼基纳米材料在抗深部耐药菌感染治疗方面的临床转化提供新的思路和借鉴。二、国内外细菌感染统计致病菌感染已成为21世纪主要的公共卫生健康问题。随着临床对抗生素的使用越来越广泛，细菌耐药性也随之变化，目前细菌对抗生素的耐药性已经成为全球关注的焦点。纵观各细菌耐药机构数据的变化，不难发现，有的细菌看似大势已去，有的细菌已经悄悄崛起，成为临床上不可忽视的挑战。近年来，深部细菌感染呈持续上升趋势，主要原因包括：长期滥用抗生素对正常菌群的破坏；对于免疫缺陷病人的放疗和化疗；艾滋病的流行；器官移植中免疫抑制剂的使用以及人口老年化等。深部细菌感染治疗作为临床常见的难题之一，有呼吸道经过血液扩散至全身，带来全身性疾病。深部耐药菌感染具有易感染、病程发展快、病死率高等特点，为此给人们敲响了警钟[7]。2018年，界卫生组织发布了首份覆盖全球114个国家抗菌药物耐药性的监测数据报告，在美国和欧洲，由多重耐药菌造成感染及死亡人数已达到较高比例；在美国、英国等发达国家以及药物监管体系较为宽松的发展中国家，抗菌药物的自我药疗现象较为普遍，加剧了耐药菌的发生和发展；多重耐药革兰阴性菌的临床分离率迅速增长，重症监护室和新生儿病房极易爆发流行，除个别“老药”和有肾毒性的黏菌素，临床可用的抗菌治疗药物几乎濒近枯竭[8]。在2018年《全球抗菌药物耐药回顾》中指出，如果目前的情况得不到改善，到2050年全球每年将有1000万人因此死亡，GDP损失近100万亿美元（图1）。这些数据对耐药菌疾病的治疗和预防敲响了警钟，开发新型抗耐药菌药物迫在眉睫。图1.2050年因抗生素耐药导致各洲死亡人数统计图2.2019年全国不同地区及不同耐药菌株的监测报告目前，我国临床细菌耐药状况十分严峻，各种常见多重耐药菌和泛耐药菌的检出率比较高，对自身免疫力差的人群危害很大。2019年国内CHINET最新细菌耐药性监测结果显示，临床主要致病菌对常用抗菌药物的耐药率呈增长趋势。革兰阳性球菌中，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌临床检出率最为显著（图2），相比2018年监测数据均有一定程度的增长[9]。因此，统计病原菌耐药变异情况以及临床上病原菌的耐药趋势尤为必要。同时，迫切需要解决目前抗生素短缺的治疗模式，也推动了非抗生素治疗策略在临床的需求。三、抗感染疗法分类（一）非抗生素抗菌策略在众多的非抗生素治疗模式中，包括化学动力学、光动力疗法和光热疗法，具有多种类型感染治疗的潜力（图3）。然而，一种有效的抗感染疗法，必须克服深部感染组织微环境给予的穿透深度低、靶点特异性低、耐药等局限[10,11]。而化学动力学疗法因持续性产生ROS且不可控，对正常组织也会造成一定损伤[12]。然而，低强度超声作为一种非侵入性技术，在临床诊断中得到了广泛的应用。图3.化学动力学治疗、光动力治疗和声动力治疗在抗感染治疗领域的优缺点近年来，声动力治疗，一种低强度超声与声敏剂的有效结合，被认为是一种有前途的抗感染的替代方法。由于所有已知的抗感染治疗，如光动力治疗、光热治疗及化学动力学疗法等，都已经得到了相当程度的独立进展，足以对其他治疗方式形成实质性的补充，因此，将这些治疗方法与SDT结合起来是非常合适的[13-15]。光热疗法受感染微环部位乏氧微环境的影响小，且局部升温可以加速声敏剂诱导ROS生成，提高SDT效率（图4）。因此，光热增强SDT可实现高效的抗感染治疗。生物材料和纳米技术的发展为SDT带来了福音，因为它在克服这些典型缺陷方面具有巨大的潜力。同时，过渡金属氧族化合物由于具有较窄的带隙结构较强的近红外光学吸收，在光热增强SDT领域受到了广泛关注。青岛科技大学朱之灵团队等采用溶剂热的方法制备了一种Ag2O2NPs，并将其用于光热增强声动力抗感染治疗[16]。因此，光热增强SDT应用于抗感染治疗也是一种趋势，互补组合成一种高效的治疗模式。然而，目前报道的光热增强SDT治疗的纳米材料主要集中在过渡金属氧族化合物及其复合物等，其光学吸收大多集中在近红外一区（780-900nm），组织穿透能力有限，一定程度上会降低材料在深部感染组织的升温效率，影响光热转换效果[17,18]。此外，大部分纳米材料的生物降解性较差，其在体内长期滞留而对机体带来不可预估的潜在毒性。因此，如何设计近红外二区（1000-1700nm）光学吸收强、SDT效率高及生物安全性高的纳米材料是当前光热增强SDT疗法所面临的关键问题之一。图4.近红外二区光热增强钼基纳米材料声敏剂ROS的产率（二）钼基纳米声敏剂众所周知，影响SDT效率最重要的三个指标，即超声，氧气和声敏剂。因此，声敏剂的开发成了首选。近年来，报道了有机和无机声敏化剂。尽管传统的有机声敏剂（如竹红素、姜黄素、卟啉及其衍生物等）有较高的生物相容性，且在SDT研究中有所积累，但其组织积累差、生物利用度和稳定性低、易被机体清除和排泄，严重限制了其进一步的临床转化[19,20]。与有机声敏剂相比，无机声敏剂（如硅基、钛基以及无机/有机杂化等基）因其较强稳定性、对生物组织的高化学惰性和价格适中而被广泛研究，但其生物降解困难，在体内存在长期毒性（图5）。其中，钛基声敏剂有较高的化学稳定性和光降低毒性，由于电子-空穴快速重组，导致ROS产率低[21]。因此，寻求和开发新型声敏用于SDT领域并提升声敏剂ROS产率是目前SDT研究领域需要解决的一个关键问题。图5.无机/有机杂化纳米声敏剂的种类然而，钼元素是哺乳动物和人类不可缺少的微量元素，常作为黄嘌呤氧化酶、亚硫酸盐氧化酶等酶的辅助因子纳米钼（VI）配合物，特别是氧化钼，在生物相容性、近红外吸附效果、生物降解性等方面的优势已逐渐被发现此外，它具有不同的价态，可以形成不同形态的氧化钼纳米材料[22]。当钼氧化物被切割成零维纳米点时，与本体形态和许多其他纳米形态相比，它们将被赋予更小的尺寸和丰富的表面缺陷，以及更多的催化活性位点。正交系三氧化钼（α-MoO3）作为一种经典的二元过渡金属氧化物，具有独特的层状结构，被广泛应用于光电器件催化光/电致变色和生物医学等重要领域。与零带隙金属性的石墨烯不同，α-MoO3具有较宽的带隙（>2.7eV）而表现出较弱的近红外光学吸收。研究发现氧空位或氧缺陷的结构可引起MoO3表面等离子体共振（SPR）效应，增强其近红外二区的光学吸收和光热转换效率，使MoO3-X纳米材料展现出优异的近红外二区光热性能。如青岛大学许元红教授团队通过MoO3构建系列钼基材料，并通过光热/光动力进行抗菌治疗，但是该体系受限于近红外一区光热性能，使得在治疗过程中受组织穿透深度的影响[23]。此外，MoO3-X纳米材料中不同价态钼离子能够与生物体内弱碱反应生成可溶性离子，赋予其优异的生物降解性能，使其在抗感染治疗领域展现出非常好的发展前景。因此，通过对MoO3-X纳米材料缺陷结构的设计可以调控其光热、声动力和生物降解等性能，有望实现高效的SDT抗深部耐药菌感染。四、构建缺陷型钼基纳米材料的方法研究现阶段制备MoO3-X纳米材料的方法主要包括“自下而上”的合成方法，如水热和溶剂热合成法；以及“自下而上”的处理方法，如高温氢气还原等离子体和激光处理等。其中水热和溶剂热等“自下而上”的合成方法主要利用表面活性剂溶剂和反应温度等手段，很难实现对氧空位的精确调控，且存在产量低和生物降解速度过快等问题。研究者也探索了“自上而下”的方法：等离子体和激光处理虽然可以在一定程度上控制缺陷含量，但是该方法需要高温高压长时间热处理的复杂操作，且无法合理控制纳米材料的形貌；而目前的高温还原也难以实现对纳米材料形貌的精细调控。因此，发展“自上而下”的水相还原策略，实现氧空位可调和形貌可控，为MoO3-X纳米材料的制备提供新方法。近年来，研究表明纳米化、剥离及插层等结构工程策略可有效调控层状材料的结构和性能。层状材料层间弱作用力的普遍存在、插层客体的多样性（分子、原子或离子）以及插层材料性能的微妙变化，为插层的研究开启了新机遇。研究人员发现，利用过渡金属原子（Sn、Co、Cu等）和有机小分子，甚至水分子都能插入到MoO3的范德华层间隙，提高插层材料的导电性和离子传输效率，从而大幅度改善材料在各个方面的应用性能[24]。近期，申请人采用正丁基锂在油相中对MoO3进行预插层，进一步水洗除去活性锂，室温下实现氧化钼的氧空位调控，增强了MoO3-X纳米材料的近红外二区光学吸收、光热转换效率和生物可降解性能。因此，基于层状过渡金属氧化物层间隙客体离子的可调变性以及插层反应的可逆特性，在申请人的前期工作基础之上，本项目提出：发展一种新的“自上而下”的制备方法，分别以MoO3和不同的碱金属离子（Li+、Na+、K+）作为插层主体和客体，利用水相离子插层技术制备M+-MoO3-X纳米材料，为MoO3-X纳米材料提供一种独辟蹊径的制备方法；插层引起的适量氧缺陷使钼离子呈现出丰富的价态（Mo6+、Mo5+、Mo4+等），钼离子通过低价态和高价态之间的切换实现氧空位结构，在超声驱动下有效阻碍电子-空穴重排，赋予其优异的SDT性能；基于目标导向的离子插层诱导氧化钼结构工程，提高材料的近红外二区光热转换效率和声动力效率，实现深部感染的近红外光热增强声动力治疗。通过进一步揭示MoO3-X的层间隙、氧缺陷能级和原子空间结构与光热、SDT及光热增强SDT的策略，促进MoO3-X生物可降解型纳米材料在深部细菌感染治疗领域的发展和应用。图6.氧空位MoO3-X纳米材料的制备、性能及其分子结构机制应用前景（一）MoO3-X纳米材料的制备与表征MoO3-X纳米材料的制备：采用水热法制备层状三氧化钼纳米带（MoO3）。将制备好的MoO3加入球磨槽中球磨得到缩短的MoO3材料。紧接着，将缩短的MoO3材料通过离子插层和还原作用得到富含氧空位的钠钼青铜纳米材料（MoO3-X），在N2氛围中进行脱水处理后得到目标产物（氧空位MoO3-X）（图7）。MoO3-X纳米材料的表征：通过扫描电镜和透射电镜对MoO3-X纳米材料的微观形貌、晶相、元素组成和纯度进行表征。利用X-射线粉末衍射和球差电镜表征分析离子插层MoO3层间隙的变化，通过电子自旋（顺磁）共振波谱仪（ESR）、X射线光电子能谱仪（XPS）和电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）测定层间隙中离子含量和氧空位结构，为优化MoO3-X氧空位和层间隙结构提供理论指导。图7.水热、球磨及离子插层技术制备氧空位MoO3-X纳米材料（二）MoO3-X纳米材料光热性能研究采用近红外二区（NIR-II，1064nm）辐射系统监测不同浓度的MoO3和MoO3-X纳米材料随着时间温度的变化，并比较两者的差异。此外，在不同辐射功率（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0Wcm-2）下监测两种材料的升温曲线，用红外热像仪记录相应的温度变化和热成像图片以便于为后续生物实验条件提供指导。（三）MoO3-X纳米材料声动力性能研究MoO3-X纳米材料声动力性能：通过超声驱动下检测活性氧物种的产生来评估MoO3和MoO3-X纳米材料的声动力性能。将MoO3和MoO3-X材料与1,3-二苯基异苯并呋喃（DPBF，单线态氧捕获剂）混合。将混合物暴露于超声，监测OD420处的衰减趋势。同样，用四甲基联苯胺（TMB，羟基自由基捕获剂）体系，通过紫外-可见-近红外光谱检测不同时间点在OD652处的变化。MoO3-X纳米材料光热增强声动力：探究在近红外二区激光照射下氧空位MoO3-X纳米材料在水溶液中的声动力性能、优化辐射的功率和辐射时间等参数，并验证MoO3-X纳米材料光热增强声动力性能，筛选出性能优越的激发条件以用于后续的抗感染治疗。（四）MoO3-X纳米材料生物安全性评估MoO3-X纳米材料体外毒性评估：将96孔板中的L929细胞（小鼠上皮样成纤维细胞）经细胞铺板和饥饿培养24h后加入MoO3和MoO3-X纳米材料于细胞培养箱中培养24h，然后每100µL培养液中加入10µLCCK-8试剂（避光），继续于细胞培养箱中培养4h，读数之前置孔板于摇床上振荡，最后用酶标仪于450nm处测定OD值。MoO3-X纳米材料体内毒性评估：构建小鼠脓肿感染模型，通过不同条件处理14天，腹腔内注射4%水合氯醛对小鼠进行麻醉，然后通过眼球采血收集血液进行血常规和血生化检测。MoO3-X纳米材料体内代谢监测：在小鼠严重脓肿感染模型接受不同处理后（PBS，MoO3-X+NIR-II+US，MoO3-X，MoO3-X+NIR-II，MoO3-X+US，MoO3-X+NIR-II+US）14天，对小鼠实施安乐死解剖取主要器官，用4%多聚甲醛溶液固定后，将这些主要器官（心、肝、脾、肺和肾）用于进行H&E染色。（五）MoO3-X纳米材料光热增强SDT研究体外抗菌活性：纳米材料的抗菌活性通过平板计数法确定。金黄色葡萄球菌（S.aureus）溶液（OD600=0.05）与纳米材料混合并用1064nm（1Wcm-2）或US（1MHz，0.5Wcm-2，50%dutycycle，5min）。每组菌液按相同倍数稀释，取20µL均匀涂抹在TSB板上，37oC孵育15h。最后，统计平板上的菌落数。细菌的形态学分析：通过SEM分析细菌的形态。在纳米材料中，将金黄色葡萄球菌（OD600=0.15）置于2.5%戊二醛中4oC固定过夜。然后将上述菌液离心（8000rpm，10min），用不同浓度梯度乙醇脱水。最后，将样品滴在硅片上，用SEM观察金黄色葡萄球菌的形态。细菌生物膜的研究：为了评估纳米材料破坏生物膜的能力，使用了金黄色葡萄球菌生物膜模型。金黄色葡萄球菌生物膜通过24孔板（Corning）附着形成，并对金黄色葡萄球菌形成的生物膜进行NIR-II和US处理。荧光染色法评估纳米材料对金黄色葡萄球菌生物膜的破坏作用。将SYTO9和PI染料混合在菌液中，通过激光共聚焦记录了金黄色葡萄球菌生物膜的完整性。细菌活/死荧光检测：金黄色葡萄球菌用100μgmL-1的纳米材料进行NIR-II照射和US。处理过的细菌在黑暗中用混合的SYTO9和PI染料活/死细菌活力试剂盒染色15min。然后拍照记录结果。体内抗菌活性研究：动物实验按照温州医科大学动物伦理委员会批准的方案进行，并遵守动物护理和使用委员会的指导方针。所有动物实验使用BALB/c小鼠（6周大，~20g）并随机分为六组。注射4%水合氯醛进行麻醉。然后注射金黄色葡萄球菌（OD600=0.5），建立小鼠严重脓肿感染模型。然后，皮下注射药物进行治疗。最后，解剖取组织通过H&E染色、Gram和Masson染色分析。组织学和免疫荧光分析：收集小鼠感染组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片进行组织学分析，切片用H&E染色，革兰脱蜡和补液后的Masson三色染色。脱蜡和再水合切片在柠檬酸盐缓冲液中于98oC加热诱导抗原修复，用于免疫荧光染色。使用CD31评估血管生成，巨噬细胞因子（TNF-α和TGF-β）和巨噬细胞表型（CD86和CD206）对感染组织修复情况进行分析。本项目拟利用离子插层技术实现MoO3纳米材料的可控制备、性能调控、生物学效应以及代谢行为研究，构建氧空位MoO3-X纳米材料，利用光热增强声动力策略用于深部耐药菌感染的治疗。详细技术路线如图8所示。图8.总体研究思路和技术路线示意图

参考文献[1]邹倩,耿苗苗,祝延红.基于循证理论构建重症监护病房患者多重耐药菌感染风险预测模型及外部验证研究[J/OL].中国全科医学:1-8[2022-03-14]./kcms/detail/13.1222.R.20220305.1915.004.html[2]彭玲,寸月娥,袁艳玲,翁晓芳,龚薇,王剑云.综合重症监护病房老年患者多重耐药菌感染危险因素分析及预测模型建立[J].老年医学与保健,2022,28(01):54-58.[3]曹云.审慎应用和对待新生儿重症监护病房多重耐药菌感染超说明书用药问题[J].中国循证儿科杂志,2022,17(01):16-17.[4]苏烟婷.胸腺肽α1联合替加环素治疗重症多重耐药菌感染的临床效果[J].临床合理用药杂志,2022,15(05):66-68.DOI:10.15887/ki.13-1389/r.2022.05.020.[5]陈玉,张朝辉,樊发超.应用主动筛查预防与控制重症监护病房患者多重耐药菌感染[J].中国感染控制杂志,2022,21(02):190-195.[6]王家鑫,司海娇,于士龙,吴雁翔,许忆峰,汪宇.糖尿病足患者多重耐药菌感染分布特征及危险因素分析[J].临床军医杂志,2022,50(02):176-179.DOI:10.16680/j.1671-3826.2022.02.17.[7]孙晓梅,张翠玲.医护人员多重耐药菌感染防控知信行现状及影响因素调查[J].卫生职业教育,2022,40(03):101-103.[8]谭婧宜,翁小玲,许梦玲.一例舌癌切除术+游离皮瓣修复患者术后伤口多重耐药菌感染的原因分析及护理体会[J].中国医学文摘(耳鼻咽喉科学),2022,37(01):192-194.DOI:10.19617/j.issn1001-1307.2022.01.192.[9]曲慧,孙海宏,王伟.失效模式与效应分析在降低ICU多重耐药菌感染中的应用效果[J].中国感染控制杂志,2022,21(01):72-79.[10]邱博慧,张朝霞,陈虹,黄雪敏.多重耐药菌感染患儿的管理与护理[J].中国卫生标准管理,2022,13(01):184-187.[11]张米镎,连博,张淑文,郭玉红,徐霄龙,刘清泉.中医药治疗耐药菌感染组方用药规律的数据挖掘分析[J].中国中医急症,2022,31(01):27-30.[12]俞娟芬,邢虎,张德厚,赵燕燕,孙艳.多部门联合干预对重症监护病房多重耐药菌感染管理的效果研究[J].中国消毒学杂志,2022,39(01):58-61.[13]谭瑞娟,王立丹,贺平,周平,郭占领.重症胸部创伤术后机械通气患者肺部多重耐药菌感染病原菌分布及危险因素分析[J/OL].中国医院药学杂志:1-6[2022-03-14]./kcms/detail/42.1204.R.20220104.1419.004.html[14]侯雪松.慢性鼻窦炎患者发生多重耐药菌感染的相关危险因素分析[J].现代医学与健康研究电子杂志,2021,5(24):1-3.[15]王盼盼.精准化监管联合多学科协作模式在重症监护室多重耐药菌感染防控中的作用[J].中医药管理杂志,2021,29(24):248-249.DOI:10.16690/ki.1007-9203.2021.24.144.[16]左铁牛,周芳芳,张亚峰,鲍