几种抑菌剂对灰霉病的抑制作用

几种抑菌剂对灰霉病的抑制作用

番茄是一种广泛种植的作物。随着反季节栽培面积的增加，番禺的运输在调节市场中发挥了积极作用。在番茄收获后的储存和运输过程中，收获后的疾病会导致不同程度的水果腐烂，严重影响矿山和货物的使用寿命，造成一定的经济损失。番茄采后病害的发生一般包括生理性病害和侵染性病害,灰霉病是常见的侵染性病害,病原真菌是灰葡萄孢(Botrytiscinerea),属于链孢霉目、链孢霉科,分布广泛易传染,可感染多种植物引发灰霉病,而且可以二次侵染,加重病害流行［１］,造成果实的腐烂。与其它采后病害相比,灰葡萄孢不仅表现出明显的潜伏侵染优势,而且在低温(4℃)条件下仍具有较强的致病性,能够侵染200多种植物,致病力强,具有能够长期潜伏侵染、适应寄主生理状态和降低寄主产生防御反应的共生亲和功能。因此,研究番茄采后灰霉病的防治具有重要意义。对于番茄采后病害,传统的防治方法是以低温结合化学抑菌剂进行处理,但化学抑菌剂处理方法导致的病原菌抗药性和农残问题备受争议。近年来,有研究［２］表明利用病原菌的拮抗菌进行生物防治具有很好的效果,但由于拮抗菌抑菌所需浓度高、不具备广谱抑菌性,难以完全取代传统防治方法［３］。也有研究将采后热处理［４］、涂膜处理等方法与上述防治方法结合［５］,得到了良好的效果。果蔬保鲜抑菌剂对于采后病害的防治具有显著效果,并且具有低毒、高效、广谱的优点。GB2760-2011规定能够在果蔬表面使用的抑菌剂有纳他霉素、茶多酚、植酸、苯甲酸钠、山梨酸钾、双乙酸钠和脱氢醋酸钠。本试验拟采用菌丝生长速率法和孢子萌发曲线法,研究几种抑菌剂对灰葡萄孢菌丝和孢子的抑制作用,以筛选效果好的抑菌剂进行复配,用以防治番茄采后灰霉病。1材料和方法1.1材料和试剂1.1.1茶多酚纳他霉素:色谱级,≥95%,上海伊卡生物技术有限公司;茶多酚:分析纯,南通飞宇生物科技有限公司;山梨酸钾、双乙酸钠、脱氢乙酸钠:食品级,南通奥凯生物技术开发有限公司。1.1.2细菌、设备及分散剂电子天平:FA2204B型,上海精科天美有限公司;自动高压灭菌锅:LS-B75L-Ⅰ型,江阴滨江医疗设备有限公司;冰箱:BCD-216型,青岛海尔电冰箱有限公司;超净工作台:SW-CJ-1D/1G型,苏州市净化设备有限公司;1.1.3病原菌的分离纯化灰葡萄孢菌株:由本试验室从感染的番茄上分离获得,经纯化、回接以及DNA鉴定确定病原菌。用于菌株分离的样本,于贵州番茄灰霉病多发区域的田间采集。1.1.4培养基马铃薯葡萄糖培养基(PDA):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂条20g,蒸馏水1000mL。1.2测试方法1.2.1生长抑菌剂的制备(1)抑菌剂介质平板的配制:采用试管二倍比稀释法,将每种抑菌剂配成所需浓度梯度的药液。然后按比例移取药液及培养基,加到培养皿中,充分混匀,冷却凝固,制成一定不同浓度梯度的抑菌剂介质平板,现用现制。空白对照用无菌水代替药液。(2)不同抑菌剂对番茄灰葡萄孢的最低抑菌浓度(MIC)的测定:根据一般抑菌剂量,植酸以2.5%的体积分数作为最高浓度,其余以1g/L作为最高浓度,每种抑菌剂介质平板设8个浓度梯度,采用试管二倍比稀释法制成相应浓度的抑菌剂介质平板,每个浓度设3次平行,制好备用。准备10６个/mL浓度的孢子悬浮液,吸取50μL至抑菌剂介质平板表面,用玻棒均匀涂布,21℃下倒置恒温培养,直至对照组中菌落铺满平板,观察生长情况,记录各抑菌剂的最低抑菌浓度(MIC)。(3)不同抑菌剂对番茄灰葡萄孢的毒力测定:采用菌丝生长速率法测定几种抑菌剂的毒力回归方程和抑制中浓度。根据以上试验8个浓度梯度间抑制率的显著性差异和最低抑菌浓度(MIC),选择合适的起始浓度,采用倍比稀释法制成含毒介质平板,设5个浓度梯度,每个浓度设3次平行,制好备用。然后沿灰葡萄孢菌落边缘,取直径7mm的菌块,倒置接种于抑菌剂介质平板中央,然后21℃恒温培养,直至对照组的菌落直径生长至培养皿直径1/2~2/3时,记录生长情况,采用十字交叉法测量菌落直径,并按式(1)计算生长抑制率。所得数据利用Origin统计软件,计算出毒力回归方程和抑制中浓度EC５０。1.2.2运行稳定性试验(1)灰葡萄孢孢子的收集和孢子悬浮液的配制:将菌饼接种于PDA培养基中央,22℃下培养,至菌落表面大量产孢,向平皿中加入适量0.3%吐温-80水溶液,并用刀片轻刮菌落表面,然后将含孢子的浑浊液震荡10min,用双层吸水纸过滤,滤去菌丝,然后低速(3000r/min)离心3min,弃上清,然后加入少量0.3%吐温-80水溶液震荡溶解,然后用血球计数板观察计算孢子悬浮液的浓度,并将其稀释至10５U/mL,现用现制［６］。(2)不同抑菌剂对灰葡萄孢孢子萌发的影响:由于灰葡萄孢孢子在清水中几乎不萌发,因此采用在PDA培养基上涂布孢子悬浮液使其萌发的方法［７］。先将不同抑菌剂配制成浓度为EC５０和EC９０的含毒介质平板(控制培养基厚度≤3mm),吸取0.1mL孢子悬浮液,均匀涂布于培养基表面,切取1.5cm×1.5cm左右大小的小块,正面向上置于载玻片中央,然后放置于灭菌平板内保湿,21℃黑暗培养观察,培养5h后开始观察孢子萌发情况,每隔1h记录1次,记录5次后停止,等24h后再观察一次,并按式(2)计算孢子萌发率。每个处理设3次平行,随机观察不少于3个以上视野,观察孢子总数不少于100个,记录孢子数和萌发孢子数。以孢子芽管超过孢子直径视为萌发［８］。2结果与讨论2.1钠、钾、双乙酸钠的抑制效应从试验结果(表1)可以看出,7种抑菌剂对灰葡萄孢的生长均有抑制效果,但抑菌效果有所差异:其中纳他霉素的MIC最低,为62.5mg/L,对灰葡萄孢的生长有很好的抑制效果;植酸和脱氢乙酸钠对灰葡萄孢的生长抑制效果中等;苯甲酸钠、山梨酸钾和双乙酸钠的抑制效果较差,浓度超过1g/L时才能达到完全抑制;而茶多酚虽有抑制,但是不能达到完全抑制。由表2可知,茶多酚对灰葡萄孢的抑制率随浓度增加呈现一个先高后低的变化趋势,而其它6种抑菌剂抑制效果随浓度变大而增加。其原因可能是由于茶多酚虽然具备一定的广谱抑菌效果,但对于灰葡萄孢的生长存在某种促进作用,并与茶多酚的抑制作用相叠加,当浓度较高时,促进作用大于抑制作用,表现出较弱的抑制;当浓度较低时,抑制作用和促进作用都较低,表现出较弱的抑制;当浓度适中时,两作用叠加产生的抑制作用最大,约为60%。2.2抑菌剂的筛选试验采用菌丝生长速率法,通过选取抑制率适中的5个抑菌浓度进行试验,并对结果进行线性拟合,求得毒力回归方程和EC５０(表3)。比较可得几种抑菌剂的EC５０:纳他霉素<脱氢乙酸钠<苯甲酸钠<山梨酸钾<双乙酸钠<植酸(折算浓度为687.9mg/L)。其中纳他霉素和脱氢乙酸钠的EC５０最低,比其它抑菌剂浓度低一个数量级,仅需21.54mg/L和33.99mg/L,对灰葡萄孢的菌丝生长有良好抑制效果。2.3不同抑菌剂对灰葡萄孢权的抑制率由于抑菌剂实际使用浓度多集中在抑制菌丝生长的EC５０和EC９０之间,菌丝的抑制效果相近,所以比较当各抑菌剂浓度为EC５０和EC９０时,对孢子萌发的影响,便于综合比较抑菌能力。抑菌剂对于孢子萌发的作用分为两种:降低最终的孢子萌发率和延缓达到最终孢子萌发率的时间,即萌发速度。由表4可知,21℃黑暗培养灰葡萄孢孢子萌发速度萌发率在8~9h后变化基本趋于稳定,并且由于24h后再萌发的孢子对整个菌落生长影响较小,所以把24h后的萌发率看作最终的孢子萌发率,作为抑菌力大小的指标进行比较。2.3.1几种抑菌剂对孢子抑制力的比较根据表4,将各抑菌剂EC９０浓度下的孢子萌发曲线进行横向比较,由图1可知:1纳他霉素可以完全抑制孢子萌发;2植酸和山梨酸钾不仅可以延缓萌发速度,同时可以大幅降低最终孢子萌发率,孢子萌发抑制率在50%以上;3苯甲酸钠只能延迟灰葡萄孢孢子的萌发速度,对最终孢子的萌发率影响较小;4双乙酸钠和脱氢乙酸钠对灰葡萄孢的萌发影响较弱;5而茶多酚可以大幅提高孢子萌发速度,处理组6h的萌发率已达91.7%,高于对照组24h的萌发率91.1%。2.3.2几种抑菌剂浓度与抑制效果的关系根据图2,将各抑制剂不同浓度下的孢子萌发曲线进行纵向比较,可知各抑菌剂的抑菌效果对抑菌剂浓度的依耐性情况,其中:1纳他霉素和山梨酸钾在EC５０浓度下,依然对孢子萌发保持高抑制率;2茶多酚在低浓度0.05g/L下,能够轻度延缓孢子的萌发,与0.1g/L时促进萌发效果相反,这与茶多酚对灰葡萄孢菌丝的抑制效果类似,其对孢子萌发的抑制或促进与其浓度有关;3植酸在EC５０浓度下,几乎不影响孢子萌发,失去了EC９０时的高抑制率;4苯甲酸钠和脱氢乙酸钠高低两浓度对孢子萌发影响较弱,EC５０时可以少许提高萌发速度;5双乙酸钠EC５０时延缓孢子萌发速度比EC９０强。2.3.3比较几种抑制剂对菌丝和孢子抑制力的区别由表4可知,在EC５０和EC９０浓度下,纳他霉素均能完全抑制灰葡萄孢孢子的萌发,其抑制效果甚至高于其对于菌丝生长的抑制,说明其抑菌能力偏向于对孢子萌发的抑制,这与张鹏的结论一致［９］。山梨酸钾的抑制能力稍弱于纳他霉素。其它抑菌剂仅能适当降低孢子萌发速度,不能改变最终孢子萌发率。除纳他霉素,其它抑菌剂对孢子萌发的抑制要远不如其对于菌丝生长的抑制。这与文献结果一致,抑制孢子萌发的MIC浓度一般要5~10倍于抑制菌丝生长的MIC浓度,因为真菌孢子萌发受生长环境影响程度较小,而生长环境对于菌丝生长的影响则较大。3几种抑菌剂的敏感性由于植物病原真菌的侵染过程比较复杂,孢子的萌发和菌丝的生长这两个环节都会影响病害的发病速度和严重程度,因此在筛选防治药物的时候,不仅需要控制菌丝生长,也要限制孢子的萌发。对于番茄采后灰霉病病原的离体抑菌试验,结果表明:纳他霉素和脱氢乙酸钠对灰葡萄孢MIC和抑制中浓度最低,敏感性最强;纳他霉素和山梨酸钾在EC５０和EC９０浓度下,对灰葡萄孢孢子萌发具有较强的抑制作用,但山梨酸钾浓度偏大。综合以上试验,对几种抑菌剂敏感性进行比较后表明(表5),