离子对高效液相色谱法测定春血安胶囊中小碱和巴马汀

离子对高效液相色谱法测定春血安胶囊中小碱和巴马汀

春血安胶囊是由地黄、三七、柴胡、牛膝、椰子和黄连组成的中药复方制剂。具有益肾健精、调经止血的功效。由于肝肾不足、压力不足引起的月经过多、经期腹痛、经期功能障碍以及经期功能障碍引起的子宫出血。处方中黄连具有防止药物过于温燥,取其清热凉血之意,诸药合用,共达温肾调经,止血固冲的作用。本实验采用离子对高效液相色谱法测定黄连中小檗碱和巴马汀含量,建立春血安胶囊的含量测定方法。1药品对照品和试剂岛津10A高效液相色谱仪,LC-10AD泵,SPD-10AV紫外检测器,C-R7A数据处理机。盐酸巴马汀对照品(批号:0732-9604,经归一化法计算,含量为98.83%,可作为供含量测定用对照品)和盐酸小檗碱对照品(批号:0713-9605,供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所。所用试剂均为分析纯。水为重蒸水。春血安胶囊及空白样品由天津第五中药厂提供。2方法和结果2.1/l磷酸二氢钠/连续剂十二烷基磺酸钠注射剂色谱柱:Turner-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠(42∶58,每1000mL混合液中加入十二烷基磺酸钠1.7g);柱温:40℃;检测波长:345nm。理论板数按盐酸巴马汀计为6000,按盐酸小檗碱计为7000,两者分离度为1.64,符合要求。拖尾因子:盐酸巴马汀为1.00,盐酸小檗碱为1.03,符合要求。色谱图见图1。2.2测定方法精密称取盐酸巴马汀对照品7.6mg置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用;精密称取盐酸小檗碱对照品10.1mg置50mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用;精密吸取上述盐酸巴马汀溶液3mL和盐酸小檗碱溶液10mL,置同一100mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,精密量取5,10,15μL注入液相色谱仪;另精密吸取上述盐酸巴马汀溶液3mL和盐酸小檗碱溶液10mL,置同一50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,精密量取10,15μL注入液相色谱仪。分别以盐酸巴马汀与盐酸小檗碱的进样量为横坐标,以各自的峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。结果表明,盐酸巴马汀在0.023~0.137μg进样量与峰面积呈良好的线性关系,回归方程Y=1925934.685X-2397.594,r=0.9999;盐酸小檗碱在0.101~0.606μg进样量与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=1861086.567X-7292.378,r=0.9999。2.3种组分对盐酸哌按处方比例及生产方法,按供试品溶液的制备方法制备缺黄连的空白对照溶液,经对空白对照溶液与盐酸巴马汀及盐酸小檗碱对照溶液测定结果比较,空白对照溶液在与盐酸巴马汀、盐酸小檗碱对照品相应保留时间的位置上无吸收峰,结果表明,样品中其他组分对盐酸巴马汀及盐酸小檗碱测定无干扰。2.4提取液用量的确定取本品内容物(批号000702),研细,取1g精密称定,置索氏提取器中,加入甲醇-稀盐酸(100∶1)50mL,加热回流至无色,移至100mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。2.5精密度测试取供试品溶液10μL,重复连续进样5次,测得盐酸巴马汀峰面积的RSD=0.80%,盐酸小檗碱峰面积的RSD=1.33%。2.6盐酸巴汀峰面积的rsd将一份供试品溶液室温放置0,2,3,17,18h后分别进样,测得盐酸巴马汀峰面积的RSD=1.91%;盐酸小檗碱峰面积的RSD=1.61%,表明本品在18h内测定结果稳定。2.7溶液制备方法测定对同一批号样品(批号为000702)分别称取5份,按照供试品溶液制备方法操作,测定,分别计算含量。盐酸巴马汀平均含量为0.6625mg/g,RSD=1.63%,盐酸小檗碱平均含量为2.9973mg/g,RSD=1.27%,表明重现性符合要求。2.8对照品溶液制备取已知含量的本品(批号为000702)内容物,研细,取约0.5g,精密称定,共6份,其中3份精密加入盐酸巴马汀对照品溶液(0.152mg/mL)2mL,盐酸小檗碱对照品溶液(0.126mg/mL)10mL;其余3份中精密加入盐酸巴马汀对照品溶液(0.152mg/mL)3mL,盐酸小檗碱对照品溶液(0.126mg/mL)15mL,于6份样品中分别加入甲醇-稀盐酸(100∶1)50mL,再按照上述试供品溶液制备方法操作,测定。盐酸巴马汀平均回收率为98.86%,RSD=1.46%(n=6);盐酸小檗碱平均回收率为99.98%,RSD=1.34%(n=6)。2.9试验结果采用上述方法测定了10批春血安胶囊样品,结果见表1。3提取溶剂的选择3.1春血安胶囊处方中有熟地、三七、柴胡、牛膝、茯苓、黄连等,其中君药为熟地、三七。最初试验是以三七中三七皂苷R1为指标,建立春血安胶囊的含量测定方法,由于三七皂苷R1吸收波长在200nm左右,吸收波长较低,处方中其他成分干扰较大,故选用该处方中黄连为测定对象,建立春血安胶囊的含量测定方法。3.2从中药制剂中提取、分离盐酸小檗碱的方法很多,多数是根据盐酸小檗碱的结构,在提取溶剂中加入一定量酸,使巴马汀与小檗碱以盐的形式溶于极性溶剂中。文献报道,提取溶剂有甲醇-盐酸(100∶1)、甲醇-稀盐酸(100∶1),由于盐酸对色谱柱、仪器及注射器等均有一定影响,因此选用甲醇-稀盐酸(100∶1)为提取溶剂。采用索氏提取、超声处理及回流提取方法,结果索氏提取法提取完全。由于盐酸巴马汀与盐酸小檗碱在甲醇溶液中为黄色,提取至甲醇无色时,则表示盐酸巴马汀与盐酸小檗碱已被提取完全,易于观察。3.3黄连中含多种生物碱,包括小檗碱(berberine)、黄连碱(coptisine)、巴马汀(棕榈碱,palmatine)、药根碱(jatrorrhizine)、甲基黄连碱(worenine)、木兰花碱(magnoflorine)等。因盐酸巴马汀与盐酸小檗碱对照品易得,故在制定标准