化学偶联的白蛋白载药研究进展

化学偶联的白蛋白载药研究进展

网络艺术1蛋白载体技术及其应用现状由于其高度可生物降解、毒性、无抗原性、患者耐药性和生物利用性的特点，氨基权利受到了生物医学领域的研究人员的高度重视，并被用作诊断试剂和药物载体。白蛋白载药体系更是成为现今药学研究中一个极具生命力的研究方向。血清白蛋白是生命体血浆中含量最丰富的蛋白质,承担着体内各种贮存和运输工作。血清白蛋白还和很多药物存在结合作用,作为载体可阻止药物从注射部位泄漏,使药物缓慢释放。近年来,白蛋白作为药物载体与小分子化合物的相互作用得到广泛的研究,这催生了一些经典研究方法,如平衡透析法、超滤法、电化学法、荧光光谱法等,和一些新的技术如毛细管电泳技术、核磁共振技术以及蛋白质结构模拟等,这些新方法新技术反过来也对药物与蛋白载体之间相互作用关系的考察起着推动作用,不断扩充着白蛋白作为药物载体的适用范围。目前应用最广泛的白蛋白主要有人血清白蛋白(humanserumalbumin,HSA)以及牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)。重组人血清白蛋白(recombinantHSA,rHSA)是近年发展的由酵母细胞表达的遗传工程蛋白质,可作为人血清白蛋白的代替品。其相对安全性、耐受性、药代动力学过程都与天然人血清白蛋白接近。临床前和临床试验已证明rHSA可安全地应用于多种疾病治疗。白蛋白载药体系主要包括化学偶联的白蛋白载药和物理结合的白蛋白载药。化学偶联白蛋白可改善药物的药代动力学特性,如延长药物半衰期,增强药物活性等,其中又可分为外源性白蛋白与药物耦合、前体药物进入体内与内源性白蛋白结合、蛋白及多肽类药物的白蛋白化,以上这些偶联技术正在被一些企业开发和应用。物理结合则可优化药物某些体外特性,包括提高溶解性和稳定性等。目前,白蛋白作为药物载体的应用还存在一些不足和缺陷,如载药量有待提高、靶向性需待增强等,正是这些迫切需要解决的问题掀起了白蛋白修饰及改性研究的热潮,白蛋白的各种衍生化即是针对其使用存在缺陷的改善。本文总结了近年来白蛋白载药技术的发展及白蛋白的修饰改性现状,重点总结了化学偶联白蛋白载药体系,即药物的白蛋白化。2其他方面的作用与正常组织相比,肿瘤组织的血管丰富、结构特殊,一个重要的表现就是血管内皮间隙较大,这是病变情况下大分子可透过肿瘤组织血管壁的原因。然而在健康组织的血管中只有小分子可以通过这一内皮屏障,通常大分子药物流体动力学半径大于2nm小于10nm(人血清白蛋白有效半径为7.2nm),能渗入肿瘤组织而不能进入正常组织。另外,在病理条件下,肿瘤细胞生长或转移时,病变细胞释放的化学物质和肿瘤衍生的甲状旁腺激素相关肽(parathyroidhormonerelatedpeptide,PTHrP)均通过产生NO和激活KATP来降低集合淋巴管“节律泵”的活性,从而影响了淋巴的生成、转运,使得肿瘤组织淋巴回流较少。分子量相对较小的物质从肿瘤间质中清除较快,而大分子被截留,因此大分子物质还可以在肿瘤组织中选择性地聚集。高的血管通透性和截留率是白蛋白作为抗肿瘤药物靶向载体的必要条件,白蛋白的这种效应符合大分子物质在肿瘤组织的透过性增强及滞留(enhancedpermeabilityandretention,EPR)效应。白蛋白在肿瘤组织中的富集作用可通过注射伊文思蓝直观地反映出来。伊文思蓝能快速并紧密结合循环白蛋白,研究表明伊文思蓝注射后6h内便可使得皮下生长的肿瘤变蓝,且随时间延长,蓝色加深,这一过程形象地表现了体液白蛋白在肿瘤组织中的聚集。Matthew等认为白蛋白是肿瘤生长的主要能量和营养源。这些对于肿瘤营养的理论主要是基于肿瘤本身能分解代谢过剩的血浆蛋白。3其他特殊的引起比临床上最早诞生的白蛋白化学偶联物是氨甲喋呤(methotrexate,MTX)白蛋白偶联物MTX-HSA,系由药物与HSA赖氨酸残基耦合得到的,关于该化学偶联物的研究至今仍在继续。另一研究的热门药物是阿霉素(doxorubicin,DOXO),与MTX-HSA不同的是,DOXO的研究比较集中在衍生化方面,其中最具特色的是将其设计成前体药物与内源性白蛋白结合。白蛋白载药的另一种做法是将多肽及蛋白类药物与白蛋白结合以提高其稳定性和半衰期,这些技术已被一些企业应用到生产实践中。要指出的是,此部分所述以白蛋白为载体的给药体系除了Levemirue5f8外,均与第4部分白蛋白纳米粒及微球不同,是指药物和载体间产生了分子链接形成白蛋白化药物。3.1mtx-hsa的生物学特性与靶向药物赖氨酸残基是建立蛋白与药物间分子链接的重要官能团,目前以白蛋白为载体的药物蛋白化学偶联物大多是在交联剂的作用下通过药物本身或其衍生物与白蛋白赖氨酸残基的游离氨基作用实现连接的,主要合成方法如图1所示。临床上,抗肿瘤谱较广且生化药理机制最为清楚的抗癌药当属氨甲喋呤(methotrexate,MTX),MTX-HSA是以白蛋白为载体的MTX共价结合物。此化学偶联物中氨甲喋呤与人血清白蛋白的摩尔比为1∶1,目前正由GermanAssociationforMedicalOncology(AIO)负责进行临床研究。研究数据表明,MTX-HSA相比MTX的优势在于,由于白蛋白的引入使药物半衰期显著延长且产生了明显的肿瘤靶向特性。在对实体瘤的治疗中,MTX-HSA相比氨甲喋呤更有活性(P<0.01),且MTX-HSA的抗肿瘤活性与肿瘤组织的血管丰度有关,血管密度高的肿瘤,MTX-HSA的渗透量比较多,且在肿瘤组织中的保留时间也较长,因此活性也较高。Ⅱ期临床研究中使用MTX-HSA与顺铂联合治疗膀胱癌,初始使用110mg/m2MTX-HSA每周给药,第8天起剂量调整到40mg/m2,顺铂以28天为一疗程,第2天起给药75mg/m2。进行研究的7名患者中,1名完全治愈,1名症状部分缓解。MTX-HSA临床评价目前在德国进展顺利,国内各机构也围绕其开展了许多基础研究。我国研究人员应用化学交联法制备抗人成骨肉瘤单克隆抗体(OSMcAb)-人血清白蛋白(HSA)-甲氨蝶呤(MTX)偶联物,并进行体外细胞毒性实验,结果发现偶联物杀伤作用在靶细胞明显强于非靶细胞(P<0.01)。磁导向下磁性MTX-HSA磁微球脑定位分布特性研究表明磁导向组导向侧大脑的MTX含量显著高于非磁导向组和对照组(P<0.05),说明磁性药物载体在磁导向下能够成功地在大脑定位分布,这一偶联物磁微球的使用前景良好。MTX不但有抗癌作用,还具有免疫抑制作用,后者可用于治疗类风湿关节炎。与癌症患者类似,类风湿性关节炎患者也时常伴以血白蛋白减少症状,这可能是因为白蛋白在发炎部位消耗用来供应氮和能量。与等浓度的MTX相比,MTX-HSA在防治胶原诱导关节炎方面的效果十分显著,且在该药物模型中与MTX能协同作用。从这个角度上看,白蛋白作为抗类风湿性关节炎和抗风湿药物靶向载体也很具前景。除了MTX-HSA外,外源性白蛋白偶联药物研究比较多的还有叶酸-HSA,它是利用叶酸的羧基与白蛋白上赖氨酸反应,通过直接耦合法合成。合成前需要二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)对药物进行活化,类似的含羧基的药物一般均可通过此法与白蛋白偶联,如阿魏酸、水杨酸等。而含氨基的药物一般利用戊二醛(glutaraldehyde)交联法偶联白蛋白,如早已有研究报道的青霉素及其衍生物系列与白蛋白的合成。以上提及的这些偶联物大都用来作为抗原,用于免疫学研究。3.2内源性白蛋白MTX-HSA的最大缺陷在于氨甲喋呤是不等量地与白蛋白分子结合,因为白蛋白上赖氨酸残基众多,只是反应的平均结合比例为1∶1,因此这一偶联物的化学结构并不清楚,其分解速率,分解产物也尚不明确。Kratz等将研究锁定在以内源性白蛋白作为药物载体方面,引入前体药物概念。即设计一种前体药物,使其静脉给药后快速并专一性地与循环白蛋白半胱氨酸-34位游离巯基结合,在血液中形成大分子运输形式。市售的白蛋白是巯基白蛋白与非巯基白蛋白的混合物,本身不纯,其半胱氨酸-34位可能填充着含巯基的化合物如半胱氨酸,高半胱氨酸或谷胱甘肽,形成二硫键交联,使白蛋白与前体药物的结合无法发生。血流中,大约70%的体液白蛋白是包含有半胱氨酸-34的缩硫醛白蛋白,这些位点没有被内源性的巯基化合物掩盖,且除白蛋白以外其余大多数体液蛋白没有游离性巯基。因此利用内源性白蛋白作为药物载体可以使蛋白与药物结合更容易,且能避免购买到病原性白蛋白。Carla等发现含顺丁烯二酰亚胺基结构的阿霉素腙衍生物(DOXO-EMCH)能快速与白蛋白半胱氨酸残基上的游离巯基结合并形成稳定骨架结构,如图2所示。这一稳定结构会因细胞质中存在的酸性溶酶体水解,在细胞内释放出DOXO。这就是上述前体药物概念最直接的体现。对大鼠的毒性研究结果显示DOXO-EMCH比单独的DOXO显现出数倍的最大耐受剂量和抗癌活性。由于耐受剂量大,DOXO-EMCH的治疗指数比DOXO有显著提升,对肿瘤模型动物实施高剂量给药必然使得其抗肿瘤效果也远胜DOXO。InnovivePharmaceuticals已将DOXO-EMCH改名为INNO-206,并列入临床研究候选药物。2007年8月,该公司公布了INNO-206的一些临床数据。临床Ⅰ期研究中,在单独DOXO按75mg/m2剂量给药会导致诸如骨髓中毒和黏膜炎等典型副作用的情况下,DOXO-EMCH的给药剂量可以在此基础上增加4.5—340mg/m2。DOXO-EMCH能够成功诱导蒽环类敏感性肿瘤(如乳腺癌、小细胞肺癌和肉瘤)退化。临床Ⅱ期针对小细胞肺癌的研究开始于2007年,目前暂时未有相关数据公布。将前体药物与在体白蛋白结合,通过在药物和白蛋白结合位点之间引入可断裂的化学键,可确保了药物在作用地点的特异性释放并让游离药物能更加充分发挥药理作用。通过对DOXO-EMCH的研究,Kratz等开发了一系列能与内源性白蛋白结合的前体药物。这些前体药物由一种抗癌药物,顺丁烯二酰亚胺基作为巯基结合部分以及酶可裂解肽接头组成。例如阿霉素前体药物可由前列腺特异性抗原(PSA)裂解;氨甲喋呤前体药物可由纤维蛋白溶酶和组织蛋白酶B裂解。3.3albuhenon-tm的应用不少蛋白及多肽药物在抗病毒、抗肿瘤以及治疗自身免疫性疾病方面担当着重要角色。对蛋白及多肽药物的开发和应用却往往遭遇到诸如稳定性差,半衰期短,成本高,存在致敏性,生物利用度低,对酶敏感等问题。近年来,利用血清白蛋白改善蛋白及多肽药物药代动力学特性的一些技术已攻克上述难关。如HumanGenomeSciences公司的融合HSA技术平台,该平台通过将人血白蛋白基因与编码活性蛋白药物的基因融合产生转位蛋白。这一融合技术最初用于类似天然蛋白衍生化,以增加其分子量,从而延长体内半衰期、避免频繁给药。后来发现白蛋白的引入使蛋白类药物更能抵抗蛋白酶的作用,并且减少致敏几率。利用这一技术,该公司研发了多种长效型蛋白类药物。例如,ZALBINTM(albinterferonalfa-2b)是HSA基因和人α-干扰素基因融合的产物;Syncriaue5f8是HSA基因和胰高血糖素样肽(GLP-1)基因融合的产物;Albuferon-αTM是HSA基因和IFNα基因融合表达的蛋白。临床前和临床数据显示,白蛋白融合技术带来的长效治疗方法,其疗效和安全性已达到或超过了现有的蛋白药物。而Albuferon-αTM更是进入了Ⅲ期临床试验,药物动力学研究表明,由于融合HSA后药物的半衰期延长,Albuferon-αTM可2—4周间隔给药,这将更有利于提高使用药物的顺应性,并防止对联合使用的抗病毒药物(如蛋白酶抑制剂)产生耐药性。再如ConjuChem生物技术公司的药物亲合构建(drugaffinitycomplex,DACTM)技术平台和预偶联药物亲合构建(preformedconjugate-drugaffinitycomplex,PC-DACTM)技术平台。当应用于一个给定的多肽药物,DACTM和PC-DACTM能在确保其治疗活性的同时,显著提高药物作用时间,提升其安全性。通过此技术的表达,能明确多肽药物与白蛋白结合后偶联物的结构。每个DAC单元包括药物、白蛋白,以及用来形成持久性结合的化学基团(通常为顺丁烯二酰亚胺结构)。对于每个DAC结构,连接分子的位置以及长度都经过优化,以确保药物和蛋白结合后母体药物依然保留相当大的活性。多数DAC肽都是通过顺丁烯二酰亚胺结构形成,其反应速度快且能专一性地与白蛋白34位的半胱氨酸残基(巯基)反应。该巯基位于白蛋白IA亚区,这一游离的巯基处在蛋白表面的疏水道中。当HSA与长链脂肪酸结合,这一疏水道就会展开,暴露这一结合位点。由于结合了白蛋白,DACTM以及PC-DACTM肽能避免快速降解和排泄,并且有效承接白蛋白其他药代动力学特性。ConjuChem的PC-DACTM:Exendin-4(CJC-1134)是Exendin-4与白蛋白的偶联物的注射制剂,这一偶联物是一种长效的结合蛋白抗糖尿病制剂,临床表现出良好的耐受性,且在Ⅰ/Ⅱ期临床实验中每周一次给药即可有效控制体内葡萄糖水平。皮下注射该产品也提高了糖尿病人用药的顺应性。将蛋白及多肽类药物以非共价连接形式与白蛋白进行黏附是另一种以白蛋白为载体的有效延长此类药物半衰期的手段,这种方法是将一段可黏附白蛋白的多肽或蛋白与细胞因子、抗体、抗原等连接,形成一个较大的分子,从而使其半衰期延长并兼具有生物学活性和治疗功能。Genentech的AB.Fab(albumin-bindingfragment)技术正是运用了以上原理。例如他们将血清白蛋白结合肽与曲妥珠单抗的Fab片段融合,使这一抗体与白蛋白的亲合力提高了10倍,血浆清除率显著减小,而结合抗原(HER2)的生物活性保持不变。还有NovoNordisk开发的多肽药物脂肪酸衍生物,这一衍生物能物理结合内源性白蛋白。白蛋白分子上有5个脂肪酸结合位点,结合常数在107—108之间。NovoNordisk已成功开发Levemirue5f8,该产品通过将胰岛素肉豆蔻酸衍生物结合于白蛋白的脂肪酸结合位点,使其达到长效作用目的。Levemirue5f8的结构如图3所示,它不同于人胰岛素的特征在于B30位去掉了苏氨酸,B29位连接了脂肪酸链,用于结合内源性白蛋白。4蛋白质颗粒的用量白蛋白纳米粒是以白蛋白为载体,包封或吸附药物,形成粒径一般在10—1000nm的一种固态胶体药物释放体系,目前主要研究的是作为抗肿瘤药物载体。白蛋白微球通常是通过化学交联或通过在高温下加入有机溶剂和稳定剂制备而成。这些粒子的体内分布主要由粒径大小决定,粒径<100nm的粒子能穿过肝窦内皮细胞窗孔,在肝部积累而不进入体循环;粒径在100—200nm的纳米粒表面经亲水性基团修饰后可避免网状内皮系统吞噬,成为长循环系统;1—3μm的小微球会被网状内皮系统摄取,并在肝和脾以及实体瘤部位聚集;15—50μm的稍大微球具有肺毛细血管床靶向功能,并适合栓塞肾脏血管;50—150μm的微球适合栓塞肝脏。因此目前,人们已经认识到白蛋白是根据其制成的纳米粒或微球的粒径大小选择性地在体内分布,所具有的是被动靶向性质,并不能有效地杀伤肿瘤细胞,所以有研究对白蛋白进行化学修饰,或在白蛋白微球上连接穿膜肽,使包裹药物的微球有效地进入肿瘤细胞。除了作为药物载体,白蛋白微球还可作为诊断试剂载体。要指出的是本部分所述物理结合的白蛋白载药并不包括有化学行为的白蛋白诊断试剂,这里只是简要介绍白蛋白在诊断学上的应用。4.1taxol和abrax-rox-1的静脉和化疗药物用白蛋白纳米粒包封研究的抗肿瘤药主要有阿霉素、氨甲喋呤等。临床应用成果的典型范例是AmericanPharmaceuticalPartners公司开发的以人血清白蛋白为载体的紫杉醇产品AbraxaneTM,这一产品成功避免了以往紫杉醇注射剂产品因溶剂问题带来的一系列副反应,并大大提高了紫杉醇的溶解性能。最早上市的紫杉醇静脉给药制剂为紫杉醇注射液(Taxol®)。1mlTaxol中含有527mg聚氧乙烯蓖麻油(CremophorEL)和49.7%无水乙醇,该溶剂系统对血管具有极大的刺激性,导致Taxol®的使用给患者带来极大的不便,需采用手术用的大的特殊输注导管才能顺利给药,且用药后还可能引起过敏反应,其静脉输注时间通常至少需要3h。这种水溶液注射剂在静脉注射前必须采用抗过敏治疗。研究显示Abraxane可以在快速生长的肿瘤中积蓄,且Abraxane具有胜过Taxol的显著优点:该产品无需前驱给药预防过敏反应,可采用标准静脉输注导管、以较Taxol高50%的剂量、于30min内静脉给药。临床试验显示,Abraxane用于治疗经蒽环类药物辅助联合化疗失败或6个月内又复发的转移性乳腺癌病人后,其疗效反应率和病人存活率都显著优于Taxol。继2005年1月获得FDA认可,Abraxane进一步地进行了诸如新辅助疗法等研究,除了一线用于治疗乳腺癌,还可用于其他癌症的治疗如非小细胞癌、卵巢癌、胰腺癌等。另外,一些基于Abraxane的研究也如火如荼地展开着,较为特色的是Priya等在Abraxane上连接肿瘤靶向肽LyP-1(CGQKRTRGC),结果表明LyP-1-abraxane相比Abraxane极显著得抑制了血管外肿瘤生长(P<0.01),提高了纳米粒的治疗活性。4.2大颗粒聚合白蛋白白蛋白微球除了具有治疗学上的运用价值,目前实际运用更为广泛的是作为诊断试剂载体。有关白蛋白载药微球的研究目前仍停留在基础研究阶段,临床应用仍然受到很大限制,因此本文不再赘述治疗学方面的应用发展情况。至于其在诊断学上的应用,早在1974年,Lyster等已开发有粒径为10—90μm的99mTc-MAA大颗粒聚合白蛋白,并用作肺显像剂。99mTc-MAA是由吸附亚锡离子的大颗粒聚合白蛋白(MAA)和99mTcO-作用,使高价锝还原成四价锝螯合而成的。这一聚合白蛋白被陆续发掘出众多作用,McDonagh等发现其用于肺灌注扫描时与甲状腺和胃的关联;Dhabuwala等将其用于选择性内放疗后转移性肝癌的诊断应答。白蛋白在诊断学方面的应用不止于此,将白蛋白与一定量的亲和素混合后可制成的白蛋白超声造影剂;白蛋白微球经外周静脉弹丸式注射可用作磁共振显像对比剂。自1987年FDA正式批准Schering生产的Magnevist进入临床,各种影像学检查试剂的发展正向着具有器官或组织特异性方向推进。5偶联物l-hsa-doxo近年来,通过各种方法修饰改性使白蛋白纳米粒或微球具有新的性质成为一个研究热点,如上述白蛋白纳米粒中提及的基于Abraxane的改性。大多数对白蛋白的修饰是针对临床使用存在缺陷的改善,目的在于提高载药量,增强靶向性等。在提高白蛋白靶向性方面研究较多的是提高肝靶向。典型的是将糖蛋白偶联物(L-HSA)的硫醇盐与DOXO结合,该偶联物会选择性地与唾液酸糖蛋白受体结合而进入肝脏细胞,通过发生细胞内摄作用在溶酶体中降解载体,这样能防止肝脏毒性及肝外副作用。该方法已在临床前研究中得到证实,偶联物L-HSA-DOXO经体内试验被证实较之单独DOXO具有高效肝靶向功能(P<0.05),且能同时抑制不表达唾液酸糖蛋白受体肝细胞癌的生长。其余可连接到白蛋白上的分子主要有甲氧基聚乙二醇(mPEG)、含巯基的分子、各种抗体、表皮生长因子及一些小分子配体等。研究证实经mPEG修饰得到的HSA-mPEG毫微球表面吸附的血浆蛋白比未修饰的要少,意味着这种微球避免了网状内皮系统的吞噬。将半胱氨酸等物质上的巯基引入HSA微球表面,再用顺丁烯二酰亚胺活化的抗生物素蛋白与巯基反应,将其连接到HSA上,这样生物素标记药物就能快速而稳定地与毫微球上的抗生物素蛋白结合,由此能构建一种高效的生物素标记药物的运载系统。表面偶联单克隆抗体能使白蛋白获得一定靶向性,但多数工作还停留在体外研究阶段,要实现体内的靶向性还需更加深入的研究。近几年研究蛋白修饰改性比较多的还有糖基化蛋白,其主要目的是探究体内生理病理过程。基础研究最为广泛的是在白蛋白中引入受体的识别配基以提高其作为药物载体的靶向性,这些配体物质主要为小分子物质,包括叶酸或糖类。这类修饰的实现主要是通过将配体分子连接于白蛋白活性氨基(主要是赖氨酸残基及末端氨基)上。在载体自组装前,将配体连接到载体的一个成分上在化学上相对容易,但这种方法的缺点是在载体的最终组装完成后,一部分结合的配体会被包入微粒的内部,从而不能与受体结合,对靶向性贡献不大,因此临床上鲜有出现利用这种方式提高白蛋白药物载体靶向