纳米粒作为蛋白质多肽类药物口服传递系统的研究进展

纳米粒作为蛋白质多肽类药物口服传递系统的研究进展

随着生物技术的快速发展，具有药理活性的异质醇生物工程迅速发展，在肿瘤、抗炎、激素调节等治疗领域发挥着重要作用。与天然或合成的小分子相比,多数肽类药物体内外稳定性较差,生物膜和消化酶两大屏障使其经黏膜吸收的生物利用度较低,故临床应用多以注射途径为主,但长期频繁注射给药所造成的肌体损伤及精神、经济压力往往令患者难以承受。因此对该类药物非注射给药途径的研究意义重大,其中口服给药因其简便、患者顺应性好、可接受程度高,而尤为引人关注。目前蛋白多肽类药物制剂面临地主要问题是:半衰期很短,而且稳定性差;分子量较大,脂溶性小,难以通过胃肠道生物黏膜;易被消化道中的各种蛋白水解酶降解而失去生物活性。长期以来国内外药学工作者采用各种策略以提高肽类药物经胃肠黏膜吸收的生物利用度(见表1),主要途径有:a.应用促渗剂及酶抑制剂。通过增加黏膜的通透性和抑制体内消化酶的降解作用来提高肽类大分子的生物利用度,但长期使用会造成不可逆的黏膜损伤和胃肠道消化紊乱。b.共价修饰。通过对药物结构进行化学修饰,增加其脂溶性从而提高膜渗透性和抗酶解能力。但修饰后的前药生物活性往往降低,其体内代谢动力学性质也会因一级结构的改变而发生变化,所产生新分子实体的安全性评价是一个长期过程。c.开发新型亚微粒载体。近年来以聚酯、多糖等高分子为载体的纳米粒递药系统越来越引起人们的关注。在人和动物小肠中存在着与免疫有关的特定组织区域,称Peyer结,该区域占整个肠道黏膜的25%左右,其特点是能让淋巴因子和一些颗粒进入血液循环系统。研究表明在小肠Peyer结的囊泡中有一种M细胞,溶酶体相对较少,它通过囊性转运方式为肠道黏膜上皮屏障提供了一个局部的功能性入口,构成了颗粒性物质非受体转运的主要生理途径。M细胞的游离面下方有丰富的吞饮小泡和微管,这是内吞颗粒转运的结构基础。纳米粒由于粒径较小,表面积增大,与生物膜的黏着性提高,进入肠道后便会大量聚集于Peyer结,携带生物大分子以完整形式透过生物黏膜,从而提高口服药物的生物利用度。1plga纳米粒对肠道组织形态的影响目前,可用于纳米药物载体研究的生物可降解聚合物包括人工合成的聚合物如:聚乳酸[poly(lacticacid),PLA]、聚乙醇酸(polyglycolicacid,PGA)、聚乳酸共聚乙醇酸[poy(lactic-co-glycolicacid),PLGA]、聚已内酯(polyglycolicacid,PCL)、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯和聚酐等(见图1)。这些聚合物一般应满足如下条件:a.良好的生物降解性;b.良好的生物相容性,无毒,不致畸,且降解反应生成的低聚物和最后产物对细胞无毒害作用;c.控释体系可与大多数药物稳定共存。其中聚乳酸(PLA)是经FDA批准的极少数可用于人体的可降解聚合物材料之一。PLA在人体内代谢的最终产物是CO2和H2O,中间产物乳酸也是体内正常糖代谢的产物,不会在重要器官聚集,因此具有优异的可生物降解吸收性。通过单体共聚的方法可以得到聚(乙交酯/丙交酯)共聚物(PLGA)、聚(己内酯/丙交酯)共聚物(PLC)、聚(乙交酯/己内酯)共聚物[poly(glycolic-caprolactone),PGC]、聚己内酯/聚丙交酯/聚乙二醇三元共聚物[poly(caprolactone-ethyleneoxide-lactid),PCEL]以及聚(乙交酯/丙交酯/己内酯)三元共聚物[poly(cactic-glycolicacid-caprolactone),PGLC]等一系列聚乳酸共聚物。本课题组研究人员与日本川岛嘉明教授实验室合作对PLGA纳米粒在大鼠消化道不同部位黏膜上皮的透过性以及用壳聚糖包衣前后在消化道的分布情况进行了研究。采用共聚焦激光扫描显微镜分别对荧光标记的PLGA纳米粒在十二指肠、空肠上段、空肠下段、回肠上段以及回肠下段等部位的吸收情况进行比较,实验结果见图2。由图2可以看出,在各肠段都可以不同程度的观测到荧光,尤其在空肠下端和回肠上部荧光强度最大,说明PLGA纳米粒对消化道不同部位黏膜上皮的透过性有所差异,而对空肠下端和回肠上部黏膜上皮的透过性最强。该结果为纳米粒系统作为蛋白类药物载体的可行性提供了实验依据和理论指导。近几年来,本课题组在国家自然科学基金的资助下,对胰岛素口服纳米粒给药系统进行了一系列卓有成效的研究工作,特别是针对胰岛素、蜂毒肽等亲水性大分子的本质严重妨碍了其纳米粒的有效包封以及体内黏膜吸收的问题,创新性地从药物的结构入手,探索通过与两亲性物质磷脂、十二烷基硫酸钠及油酸钠等形成离子对复合物(见图3),以期达到改善水溶性多肽的亲脂性和口服吸收效率的目的。胰岛素-磷脂复合物PLGA纳米粒(Ins-SPCNP)灌胃给药对糖尿病模型大鼠有比较显著的降血糖作用,但降糖强度比较温和、缓慢。Ins-SPCNP灌胃2h大鼠血糖即开始下降,4～8h血糖下降幅度最为明显,可以下降至初始血糖水平的50%～65%,与口服胰岛素溶液组有显著性差异;8h后大鼠血糖下降进入平台期,随后始终保持较低的水平,未观察到血糖恢复上升现象,24h血糖浓度为初始水平的50.5%,与口服胰岛素溶液组有显著性差异。正常大鼠灌胃口服Ins-SPCNP的相对药理生物利用度计算为8.69%(见图4)。胰岛素-S.O复合物PLGA纳米粒灌胃给予糖尿病模型大鼠2h后,即产生了明显的降糖效果,血糖值于4h内降至初始水平的(70.15±10.07)%,并于此后一直保持较好的水平,12h降至初始水平的(23.85±13.01)%,此作用一直持续到24h以后,其相对药理生物利用度为11.41%(见图5)。蜂毒肽-SDS复合物PLGA纳米粒蜂在结肠和回肠吸收比较好,在十二指肠吸收最差,平均吸收率仅7%左右(见图6)。对蜂毒肽纳米粒在各肠段的吸收率进行组间T检验,结果表明,纳米粒在回肠段的吸收率高于十二指肠和空肠,其中与十二指肠段的差异具有显著性(P<0.05);在结肠段的平均吸收率高于十二指肠和空肠,其中与十二指肠段的差异具有显著性(P<0.05);纳米粒在回肠段和结肠段的平均吸收率相差不大,差异无显著性(P>0.05)。采用H22鼠肝癌(腹水型)为实验瘤种、昆明种小鼠为造模对象,考察蜂毒肽及其纳米粒制剂的体内抑制肿瘤细胞生长作用,结果表明,注射蜂毒肽1.5mg·kg-1·d-1时对小鼠H22肝癌瘤重抑制率达到50%以上,体内抑瘤作用很明显,口服大剂量蜂毒肽纳米粒制剂比小剂量的抑瘤作用大,说明抑瘤作用有一定的剂量依赖性,口服30mg·kg-1·d-1蜂毒肽纳米粒制剂对小鼠H22肝癌瘤有非常显著的抑制作用(P<0.01,T-test),而口服蜂毒肽溶液30mg·kg-1·d-1对小鼠H22肝癌瘤的抑制作用无显著性(P>0.05,T-test),见图7。2壳聚糖与胰岛素的相互作用壳聚糖(chitosan)是甲壳质脱乙酰化衍生物,化学名称为(1-4)-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖,或简称聚胺基葡萄糖。其大分子结构中存在大量氨基(见图8),从而大大改善了甲壳素的溶解性和化学活性,因此使它在医疗、营养和保健等方面具有广泛的应用价值,是仅次于纤维素的第二大多糖类,资源十分丰富。壳聚糖具有很好的生物相容性和生物活性,且无毒,易于生物降解。壳聚糖分子中具有氨基与羟基,溶解在稀酸中能形成高黏度的胶体溶液,其水溶液是阳离子电解质,具有很好的絮凝作用。壳聚糖的氨基具有阳离子交换功能,当pH值<6.5时有高电荷密度,能吸附在负电荷表面,与许多金属离子螯合。壳聚糖为高分子量的线型聚胺,其分子上的氨基易发生化学反应,在温和条件经化学修饰后可开拓广泛的应用领域。壳聚糖纳米粒通常采用离子凝胶法制备。在壳聚糖离子交联水凝胶中,交联剂所带的负电荷与壳聚糖分子中带正电荷基团之间的离子作用是该凝胶网状结构内部最为主要的作用方式。其性质取决于交联剂的种类。作为常用交联剂的金属离子,能够在壳聚糖分子上带正电荷的氨基之间形成共价键,这种共价键要比阴离子交联剂形成的静电作用强的多。除了带正电的氨基之外,壳聚糖分子链上的其他基团,如羟基,也可以与离子交联剂发生反应。可以与壳聚糖发生离子交联形成水凝胶的离子交联剂主要有β-甘油磷酸、柠檬酸盐以及三聚磷酸钠等。本课题组采用壳聚糖与胰岛素复合制备纳米粒。胰岛素的pKa值为5.4,壳聚糖的pKa值为6.5。使溶液的pH控制在5.4～6.5之间,使胰岛素带负电,壳聚糖带正电,利用正负电荷的相互作用制备胰岛素和壳聚糖的复合物,再通过离子交联法制备成纳米粒,以达到提高包封率和降低突释的目的。未包衣的胰岛素-壳聚糖复合物纳米粒在糖尿病模型大鼠体内具有明显的降血糖作用。2h的血糖浓度即降低为0时血糖的(71.63±4.70)%,而从4h至24h这段时间内,血糖浓度始终降低至67%以下,而最低值出现在24h,为(56.22±3.97)%(见图9)。肠溶包衣胰岛素-壳聚糖纳米粒对糖尿病大鼠的降血糖作用强于未包衣复合物纳米粒,其24h相对生物利用度(与皮下注射比)分别为11.19%和16.29%。本课题组与日本川岛嘉明教授实验室合用,采用共聚焦显微镜观察荧光标记的PLGA纳米粒及壳聚糖包衣的PLGA纳米粒,结果表明(图10)经壳聚糖表面修饰的纳米粒荧光(绿色)强度较未包衣显著增强,从顶端→基底端的连续光切图像显示穿越部分的绿色荧光主要沿细胞骨架分布,提示纳米粒通过细胞间隙途径被转运。壳聚糖包衣纳米粒被Caco-2细胞摄取后细胞骨架F-actin蛋白显著地减少,荧光强度明显减弱甚至消失,并且分布呈不联系性,节点明显增多,整体荧光强度与未包衣纳米粒作用组相比明显减弱(见图11)。研究表明经壳聚糖表面修饰的纳米粒可使细胞周围的“F-actin环”的发生解散而影响细胞之间的紧密连接。3对纳米粒吸收的影响纳米粒作为口服传递多肽与蛋白质类药物载体的研究正日益深入,虽然在促进纳米粒胃肠道吸收方面已经取得了一些进展,但同时也存在极具挑战性的难题。很多研究都表明,粒径适宜的纳米粒能够通过胃肠道有效吸收,但透过胃肠黏膜屏障进入循环系统的药物浓度极