生物技术药物的药代动力学研究进展

生物技术药物的药代动力学研究进展

生物技术方法生产的天然药物，用于疾病的诊断、治疗或预防，被称为生物技术药物（biotechdrugs）和互补基因工程药物（官方医学）。从1982年美国Lilly公司第一个基因工程产品——人胰岛素上市至今,已有140多种生物技术药物相继上市。随着分子生物学、基因工程和基因组学的研究发展,生物技术药物的种类正在日益增多,治疗疾病的类别也越来越多。现在的生物技术药物包括了应用DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞因子类药物,也包括用蛋白质工程技术生产的上述药品的修饰物,还包括用于基因疗法的治疗基因和核酶等。目前生物技术药物的研究逐渐从基础研究转向临床应用,为了正确评价各种生物技术药物在人体内的疗效及安全性,必须对其进行药代动力学的研究。而与传统的药物相比,生物技术药物具有种族特异性、免疫原性和非预期的多向活性等特点,这使得其在体内的药代动力学研究受到诸多因素的限制,尤其是测定方法的建立遇到很大困难,因此选择正确的药代动力学研究方法至关重要。下面就以3类生物技术药物为例,综述近几年来生物技术药物的药代动力学研究进展。1预防自身致病性疾病蛋白多肽类药物对维持机体的正常功能具有重要作用,并可用于治疗严重威胁人类健康的肿瘤、病毒性肝炎、艾滋病及一些自身免疫性疾病,这类药物还包括用于引起严重急性呼吸综合征(SARS)的病毒早期快速诊断的蛋白芯片、SARS疫苗等。蛋白多肽类药物的药代动力学十分复杂,受给药途径、给药方案、结合蛋白、种属差异、内源性物质等多种因素影响。1.1药房的动态特征1.1.1分子质量变化蛋白多肽类药物相对分子质量大,对蛋白分解酶敏感,在生物体血浆中被快速清除,因此其口服给药后难以进行系统转运。一般认为,小分子肽的吸收是通过被动扩散或载体转运;脂溶性大分子蛋白多肽可通过膜脂扩散,其中高度亲脂性的蛋白多肽则通过淋巴系统被吸收,而水溶性蛋白多肽可通过水合孔和(或)细胞间隙扩散,经内吞或胞饮过程被摄取进入细胞。近年来有报道称,一些细胞转运肽(cellpenetratingpeptide)可通过非耗能途径穿过真核细胞的质膜,这些多肽已被成功地用于在细胞内转运比自身的相对分子质量大许多倍的大分子物质。1.1.2蛋白多肽类药物与小分子药物的分布不明确大多数蛋白多肽类药物具有相对分子质量大和水溶性的特点,若无主动的转运或消除机制,它们大多保留在细胞间隙。由于与血浆或组织蛋白的高结合率等原因,蛋白多肽类药物的分布容积多为0.04～0.2L/kg,而小分子药物多为1～20L/kg,显著限制了该类药物的分布和药理作用。该类药物与血浆蛋白广泛而有力的结合不利于其到达消除部位,从而导致其清除率下降。蛋白多肽类药物在体内通常与相应受体结合而引起代谢,因而受体在组织器官中的分布往往对药物在体内的分布及效应产生重要影响。大多数该类药物因血-脑脊液屏障(BBB)而无法进入中枢神经系统(CNS),此屏障中缺乏特异转运系统,却可能存在蛋白分解酶。1.1.3p-gp对cyp3a4的调节作用体内存在的蛋白多肽酶可使相应的蛋白质和多肽迅速失活,这是蛋白多肽类药物的主要代谢途径。胃肠道腔管内分布着大量特异酶,结肠、回肠中相对较少。有报道称,小肠中的细胞色素P4503A4(CYP3A4)对口服蛋白多肽类药物的代谢起主要作用,小肠中的P糖蛋白(P-gp)有减少药物吸收和调节CYP3A4的双重作用。肝摄取肽类的机制包括对疏水性多肽的被动过程和对亲水性多肽的主动过程。主动过程又可分为胞吞作用和载体介导转运,未被特异机制消除的大部分水溶性多肽被认为通过胞吞作用进入肝细胞。肝脏中参与蛋白多肽类药物代谢的物质有:组织蛋白酶溶酶体、氨肽酶等。经肾小球滤过的大分子蛋白多肽通过胞吞和溶酶体降解而被清除;经肾小球滤过的小分子蛋白多肽则通过近端肾小管刷缘酶水解成氨基酸,被特异氨基酸转运系统吸收,其间多肽也可能是先断裂成小肽,再转运至近曲小管上皮细胞内,在胞内水解。蛋白多肽类药物在血液中通常不太稳定,主要是因为血液中也有酶的存在,现已知分布在血液中的相关酶主要有二肽酶Ⅳ(DAPⅣ)、后脯氨酶断裂酶(PPCE)和氨肽酶。此外,有报道说,一些对蛋白多肽酶稳定的蛋白多肽类药物也可能在体内的解毒系统中被代谢,如环孢菌素。1.1.4有更多有限制的消除机制肾脏在蛋白多肽类药物的排泄中起重要作用,肾小球可滤过相对分子质量小于3×104的蛋白,如干扰素、白介素等。肾小球滤过这一消除机制的能力有一上限,若单靠滤过,蛋白多肽类药物至少有40分钟的半衰期,但大多数该类药物的半衰期要短得多,说明体内存在其他更有效的消除机制。较大的多肽常通过受体介导或形成无活性物质而被清除,有不少例子显示受体介导清除可能是主要的清除机制之一,如胰岛素,若减小其与受体的亲和力,就会显著延长其血浆半衰期,且胰岛素受体的抗体也可延长其半衰期。1.2生物特征及其应用上述蛋白多肽类药物的药代动力学特点决定了其研究的复杂性和困难性。目前,其研究中遇到的最主要的问题在于,蛋白多肽类药物和内源性蛋白多肽都由氨基酸组成,结构性质相似,难以分离、提取和纯化;在药代动力学研究中,目标蛋白多肽给药量小,血药浓度极低,而各种内源性蛋白含量要高出其数千上万倍,这种干扰给目标分子的有效提取和准确测量增加了难度。因此,建立对目标生物制品特异性强、灵敏度高的分析方法是此类药物药代动力学研究成功的前提和关键。目前,蛋白多肽类药物的药代动力学研究的分析手段有生物检定法、放射性核素标记示踪法、免疫分析法和液相色谱(LC)、毛细管电泳(CE)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)以及联用技术等,其中,生物检定法发展较早,但灵敏度低;放射性核素标记示踪法及免疫分析法较为常用;色谱法的应用也比较普遍,但不能提供结构信息;而以LC-ESI-MS、LC-MALDI-TOF-MS及CE-MS等为代表的联用技术近年来得以不断完善和发展,既可以分离样品及其代谢物,又可以提供分子结构及分子质量信息,这为蛋白多肽类药物的药代动力学研究提供了必要的技术手段。以下仅对其中两种新兴的分析方法——酶联免疫(ELISA)法和LC-MS法的应用作一介绍。1.2.1检测抗体的制备蛋白多肽类药物具有免疫原性,因此可以采用免疫分析法测定生物样品中的蛋白多肽类药物,而ELISA法就是其中最常用的一种方法,具有灵敏度高、重复性好、可自动化、非放射性、高效且适合批量测定等优点。它的原理是,被测药物依然为抗原,先与固定相上的抗体形成复合物,再与标记酶标记的抗体结合,形成抗体-抗原-酶标记抗体夹心状复合物,最后加入酶标底物即可显色。由于抗原需有两个抗体来识别,这就大大增加了方法的特异性,是一种灵敏而低变异的方法。刘健等在I期临床试验中,采用ELISA法进对重组人肿瘤坏死因子DK2进行了药代动力学研究,测得其体内药代动力学呈一房室模型,其体内代谢过程与原形肿瘤坏死因子-α相似。ELISA法的主要缺点是不能对蛋白多肽类药物作完全的鉴定,如确切的生化组成和氨基酸序列等;不能区别药物的活性形式和无活性形式;药物的部分降解可能改变或消除它与探针抗体的相互作用;不能够同时测定生物技术药物及其代谢产物;会受到大量的内源性或外源性物质,如结合蛋白、代谢产物以及形成的抗体或混合物的干扰。但它仍是目前较为实用的蛋白多肽类药物药代动力学研究方法,已开发出能满足数十种蛋白多肽药代动力学研究的ELISA商品试剂盒。在目前的临床药代动力学研究领域,ELISA法已逐渐取代生物检定法,并且已有不少实验证明,它与生物检定法具有一定的相关性。1.2.2药物的药代动力学研究色谱法的肽谱分析只能给出肽段在LC上的分离图谱,而不能对每一肽段进行定性鉴定,除非再收集每一肽段进行序列分析,工作量较大,且在处理过程中,经常会使样品中的一些组分丢失。而LC-MS和CE-MS等联用技术用于复杂体系分离分析十分有效,在蛋白多肽类药物药代动力学研究中发挥重要的作用,其中LC-MS法的应用越来越多。LC-MS联用技术在选择性、灵敏度、分子质量测定和提供结构信息等方面具有明显的优势,能够同时获得可靠的定性和定量结果,国内外已将LC-MS法用于蛋白多肽类药物的药代动力学研究。如Changa等采用LC-MS/MS法测定了一种人免疫缺陷病毒细胞膜溶解抑制剂T-20/Ro29-9800及其代谢物(M-20/Ro50-6343)在人血浆中的浓度,该方法的优势在于此抑制剂的测定线性范围达到10～2000μg/L,其低、中、高浓度的相对标准偏差(RSD)和回收率均满足药代动力学的要求。用LC-MS法测定生物样品中的药物及其代谢物时,需要进行蛋白沉淀、液相或固相萃取(SPE)等前处理操作,既费时又会影响结果准确性和精密度,其解决方法主要有采用浸透限制的固定相、含有表面活性剂的流动相、柱切换法等。其中,常用的柱切换法是将前处理用色谱柱或其他装置和分析用色谱柱在线连接,从而实现在线分离。Dai等研究设计并优化了在线SPE-LC-MS自动化分析系统,使该系统既适用于高度复杂的血浆、血清样品制备的在线分流进样模式(OSIM),也适用于相对简单的生物样品如尿样的直接进样模式(DIM),有效地解决了该系统分析中经常遇到的萃取柱使用寿命短、大体积样品前处理困难、萃取效率低和重现性差等问题。在猕猴单次皮下或静脉注射西夫韦肽的药代动力学研究中,采用OSIM-SPE-LC-MS-MS系统,前处理选择单一固相萃取柱,成功地测定了300多个血浆样品。鉴于蛋白多肽类药物的特殊性,目前尚无一种可完全满足其药代动力学研究要求的分析方法。一般来说,在动物药代动力学研究阶段,首选放射性核素示踪法结合电泳法或HPLC法进行全面药代动力学研究,同时选用免疫分析法和生物检定法测定血液药物浓度的动力学。用两种以上方法彼此互相补充和验证,可获得可靠并与临床研究衔接的药代动力学资料,是进行此类药物药代动力学研究的最佳选择。在蛋白多肽类药物的吸收和分布研究中,发展新技术以获得可靠的临床药代动力学参数也很重要。如DeSmedt等发展的visualFARP方法,通过显微显像技术,在计算机屏幕上观察蛋白多肽类药物的药代动力学过程,能快速、准确地检测其在体内的分布和吸收。2a上发挥作用的药物核酸药物是指在核酸水平(DNA和RNA)上发挥作用的药物,主要包括反义核酸药物(包括反义RNA、反义DNA及核酶)、RNA干扰药物、DNA疫苗等。2.1用药动力学研究反义核酸药物是一种新型的治疗药物,为人工合成的DNA或RNA片段,其核苷酸序列可与靶mRNA或靶DNA杂交,抑制或封闭该基因的转录和表达,或诱导RNaseH识别并切割mRNA使其丧失功能,从而发挥治疗作用。反义核酸药物可用于病毒感染性疾病、多种类型肿瘤、代谢性疾病以及血管性疾病的治疗。第1个反义药物福米韦生(fomivirsen,ISIS2922)已于1998年被美国FDA批准上市,临床上用于治疗巨细胞病毒(CMV)引起的视网膜炎。目前尚有10余种反义药物正处于临床研究当中,关于这类药物的药代动力学研究也是近来的热点之一。Geaxy等在反义寡核苷酸ISIS301012(一种新型的ApoB反义抑制剂)的Ⅰ期临床实验中,考察了口服降脂药(辛伐他汀和依泽替米贝)与ISIS301012联用时潜在的药代动力学相互作用,采用反相HPLC法测定血液中ISIS301012含量,结果显示,与辛伐他汀或依泽替米贝合用时,ISIS301012的AUC0-24hr、Cmax和t1/2都没有显著性变化,且其血浆蛋白结合率也没有发生显著变化。这表明,ISIS301012与口服降脂药合用时,其药代动力学仅受很小干扰,为其进一步开发提供了保证。OGX-011是第2代优秀的丛生蛋白(clusterin)mRNA反义药物,可抑制丛生蛋白在异种移植物模型中的表达,因此能增加机体对癌症治疗的敏感性。Chi等在25位重症前列腺癌病人行切除术前,给予其7次静脉滴注OGX-011治疗(每次间隔1天给药),治疗期间分别测定OGX-011在血浆和前列腺组织中的浓度,采用RT-PCR、原位杂交和免疫组化法在前列腺组织、淋巴结、连续取样的血液单核细胞和血清中检测丛生蛋白的表达情况。结果发现,OGX-011的体内半衰期为2h,AUC与给药剂量呈线性关系;前列腺组织中OGX-011浓度随给药剂量增加而增加;丛生蛋白在前列腺癌细胞中的表达随给药剂量增加而减少。可见,OGX-01耐受性良好,能抑制丛生蛋白在重症前列腺癌患者中的表达;Ⅱ期临床研究的参考给药剂量为640mg,针对前列腺癌、乳腺癌和肺癌可以考虑采用OGX-011与激素联合治疗方案。2.2链小干扰rna部分RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是一种由双链RNA诱发的基因沉默。在此过程中,与双链RNA有同源序列的信使RNA被降解,从而抑制了该基因的表达。RNA干扰技术作为一种高效的序列特异性基因剔除技术,在传染性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速,但有关其产品的药代动力学研究报道还不是很多。Braasch等采用放射性核素标记法观察新合成的双链小干扰RNA(siRNA)在大鼠体内的生物分布和药代动力学特性,判断磷硫酰的加入对siRNAs体内行为的影响。实验制备了两种双链siRNA,一种是由两条磷酸二酯链组成的常规双链(PO/PO),另一种则是由一条磷酸二酯链和一条磷硫酰链组成的新型双链(PO/PS)。在给小鼠静脉注射123I标记的PO/PO型siRNA后10分钟内,每隔1分钟拍摄照片,观察siRNA在小鼠体内的分布,结果显示,在注射后1分钟,肝和肾就开始有siRNA存在,5分钟时达到峰值,且膀胱中出现明显标记物,说明siRNA已经被快速排泄。而用125I分别标记两种siRNA双链,给小鼠静脉注射后取组织,采用荧光闪烁计数法测定各组织中的siRNA浓度,结果发现,在所有时间点,siRNA优先在肾和肝中累积,在肺、脾和心脏中含量相对较少,在脑中几乎没有,说明siRNA不易穿过BBB;且PO/PS型siRNA在血液中的浓度较PO/PO型高,证明PO/PS型siRNA在血浆中的稳定性高;另外,在前4小时,PO/PS型siRNA在脾、心脏和肺中的浓度增加,而在肝、肾中的浓度减少,可能是因为磷硫酰的引入使得siRNA循环浓度增加。然而这一现象不是很明显,说明磷硫酰的引入对siRNA的生物分布有一定作用,但不是很重要。2.3种植物基质粒在猪体内的药代动力学研究DNA疫苗是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上而获得,然后将重组的质粒DNA直接注射到机体内,使外源基因在活体内表达,产生的抗原激活机体的免疫系统,引起免疫反应。它作为一种新的免疫手段,问世不久就在感染性疾病及肿瘤的防治中显示出巨大的应用潜力。DNA疫苗注入机体后的存留时间、能否自我复制、在体内如何代谢降解、组织分布以及能否整合到宿主细胞中等药代动力学问题是目前人们普遍关心的,也是制约其投入临床应用的瓶颈。DNA疫苗的免疫效应在国外研究较多,然而其药代动力学的研究报道甚少,国内还未见报道。Gravier等对狂犬病病毒质粒DNA疫苗在猪体内的组织分布和药代动力学进行了研究,这是对大型动物肌肉注射DNA疫苗进行药代动力学研究的首次报道。在该项研究中,先构建编码狂犬病病毒糖蛋白B、C、D的3种pcDNA质粒,混合后给药,于不同时间点取血样和组织,并用蛋白酶K处理后,分别用德国Qiagen公司生产的QIAampDNAMiniKit和QIAampDNAMinEluteVirusSpinKit试剂盒从组织液和血液中抽提DNA,实时定量PCR法测定各DNA含量。最后经统计发现,3种质粒在注射部位肌肉、前肩胛骨淋巴结、脾、肺、肝、肾和子宫均有一定分布,但有很大的器官分布差异;3种质粒在血浆中的Tmax都在12.3～17.3min之间,但它们的峰浓度Cmax和半衰期均有很大差别;经计算,肌肉注射后的生物利用度很低,表明进入血液的质粒比较少。对上述3类核酸药物进行成功的药代动力学研究的关键是,选择合适的生物样品定量分析方法。目前核酸药物的临床前和临床药代动力学研究中最为常用的定量分析方法有两大类:放射性核素法和非放射性核素法,后者又包括毛细管凝胶电泳(CGE)、HPLC、MS、杂交技术等方法(见表1)。3i/iii期临床研究单克隆抗体是指由淋巴细胞杂交瘤产生的、只针对复合抗原分子上某一单个抗原决定簇的特异性抗体,它在测定、提纯活体或细胞中的微量物质以及活体定位等方面都表现出明显优势,已经开始应用于以癌症为首的各种疾病的诊断和治疗。近年来,抗体类药物在生物工程制药业中的地位逐渐突显,开发速度加快,而单克隆抗体类药物目前占开发中生物技术药物的三分之一,毫无疑问,已成为世界生物工程制药业的支柱产品。有报道说,表皮生长因子受体(EGFr)是干预治疗头颈部扁平细胞癌(SCCHN)的重要靶点,而EGFr的单克隆抗体在单独或与放疗、化疗联合治