浅谈腐植菌放射毛霉蛋白酶的定位及释放

浅谈腐植菌放射毛霉蛋白酶的定位及释放

1病原菌蛋白质的分离和分离酶是酶制剂行业最重要的组成部分之一。它主要来自微生物，广泛应用于洗涤剂、制药、纺织工业和食品行业。目前,大多数的微生物蛋白酶来源于细菌,但在食品工业中,真菌蛋白酶正受到日益的重视。酶在细胞表面的定位对微生物的生化和生理具有非常重要的作用。大部分霉菌可以产生相当数量的蛋白酶,根据微生物的不同,可以是胞外酶或膜酶。HWAL.WANG、鲍松林及李理等人用不同的盐溶液对腐乳生产菌株冻土毛霉(MucorhiemalisNRRL3103)、布氏毛霉(M.hiemalis)和梨形毛霉(M263-3)蛋白酶的提取进行了研究,结果表明这些毛霉分泌的蛋白酶主要是以离子键松散结合在菌丝表面的胞外蛋白酶。雅致放射毛霉(ActinomucorelegansAS3.227),异名匍匐放射毛霉,是我国传统腐乳酿造中常用的优良菌种之一,目前对其蛋白酶的研究不多,Han报道了固态培养条件下温度和湿度对产蛋白酶的影响,但对其菌丝蛋白酶准确定位及释放的研究尚未见报道。在此背景下,本文对固态培养获得的雅致放射毛霉进行了蛋白酶定位及释放的研究,为有效开发利用雅致放射毛霉蛋白酶提供理论依据。2材料和方法2.1elegnsas3.1333.133菌种:雅致放射毛霉(ActinomucorelegansAS3.227),由北京王致和腐乳厂提供;豆腐坯:由北京王致和腐乳厂提供,切成2.5×2.5×2.4cm的方块。2.2干u、jy98-超声波细胞破碎试剂:三氯乙酸等化学试剂均购于北京试剂公司;干酪素购于Sigma公司;JY92-Ⅱ超声波细胞破碎机:上海新芝生物技术研究所;GL-20B冷冻离心机:上海安亭科学仪器厂。2.3方法2.3.1马铃薯-葡萄糖-水处理马铃薯-葡萄糖-脂质液的制备雅致放射毛霉于4℃保存在马铃薯-葡萄糖-琼脂斜面培养基上,使用前于25℃在马铃薯-葡萄糖-琼脂斜面培养基上培养7d,斜面上加入灭菌后的蒸馏水,震荡1min,制取孢子悬浮液。在豆腐白坯上接入孢子悬浮液,25℃培养48h,剥取毛坯上菌丝,用不同方法提取蛋白酶后用来分析。2.3.2测定酶活性紫外分光光度法2.3.3酶活测定在10g湿菌丝中分别加入10倍重量的0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M和0.6M的NaCl溶液,25℃摇动浸泡1h,冷冻离心(10000g)10min,上清液用来分析酶活。2.3.4酶活测定m在10g湿菌丝中,分别加入10倍重量的0.3M的KCl、CaCl2、MgSO4和(NH4)2SO4溶液,25℃摇动浸泡1h,冷冻离心(10000g)10min,上清液用来分析酶活。2.3.5酶活测定在10g湿菌丝中,分别加入10倍重量的0.3M的葡萄糖、蔗溏、尿素溶液和水,25℃摇动浸泡1h,冷冻离心(10000g)10min,上清液用来分析酶活。2.3.6温度对酶释放的影响取10g湿菌丝,加入10倍重量的0.3M的NaCl溶液,4℃摇动浸泡1h,冷冻离心(10000g)10min,上清液用来分析酶活。2.3.7不同超声波提取酶活取10g湿菌丝,加入10倍重量的水,4℃摇动浸泡1h,冷冻离心(10000g)10min,同法共提取3次;然后,同法用0.3M的NaCl溶液中,超声波处理(60Hz,90次,5s/5s间隔),冷冻离心(10000g)10min。上清液用来分析酶活。将上述经水和盐提取后的菌丝浸泡于水中,同法超声波处理、冷冻离心,上清液用来分析酶活。2.3.8盐提取对酶释放的影响在上述沉淀菌丝中,加入10倍重量的0.3M的NaCl溶液,同法共提取三次,上清液用来分析酶活。3结果与讨论3.1盐、金属的浓度对乳状液中pacl酶活力的影响不同浓度的NaCl溶液以及KCl、CaCl2、MgSO4和(NH4)2SO4溶液浸泡菌丝后,浸泡液中蛋白酶活力见图1和图2。由图1可见,NaCl溶液可以将雅致放射毛霉蛋白酶从菌丝上释放出来,释放出来的酶量与NaCl的浓度有一定的关系。当NaCl的浓度在0.3M时,提取液中酶活力最高,说明释放效果最好。当盐的浓度高于0.4M(约2.34%)时,蛋白酶的释放效果逐渐减弱。通常人们认为,腐乳生产中盐不仅可以抑制微生物的生长、赋予产品以咸味,而且可以释放菌丝附着的蛋白酶,并使之渗透到豆腐坯体中作用于蛋白质。腐乳毛坯腌制时,盐的浓度高达16%以上,因此,高盐浓度不仅会抑制蛋白酶的活力,也不利于蛋白酶的释放。除NaCl溶液外,KCl、CaCl2、MgSO4和(NH4)2SO4溶液也可以将雅致放射毛霉蛋白酶从菌丝上释放出来(见图2)。由于上述提取液是不同种类的离子溶液,因此,离子溶液可以将雅致放射毛霉蛋白酶从菌丝上释放出来。3.2不同浓度下幼果小型蛋白酶的释放0.3M的NaCl溶液在0℃和25℃浸泡菌丝后,提取液中蛋白酶活力见图3。图3表明,雅致放射毛霉蛋白酶的释放在0℃时可以快速发生,释放出的酶是25℃时释放的86%左右。因此,盐对蛋白酶的释放可能不涉及任何生化反应,在菌丝表面有松散结合的蛋白酶,这部分蛋白酶属于细胞表面酶。3.3保乳手术后gd-ld-ld-ld-ld-l用葡萄糖、蔗糖、尿素、水浸泡菌丝,提取液中蛋白酶活力见图4。图4表明,非离子溶液葡萄糖、蔗糖、尿素和水对雅致放射毛霉菌丝蛋白酶具有一定的释放能力,其中相同浓度的葡萄糖、尿素和水对蛋白酶的释放效果要好于蔗糖。由于离子溶液和非离子溶液对雅致放射毛霉菌丝蛋白酶都具有相当的释放能力,因此,雅致放射毛霉蛋白酶与菌丝的结合方式并不只限于离子键或非离子键的形式,与冻土毛霉等蛋白酶在菌丝表面的结合方式是有差异的,这与雅致放射毛霉菌株本身的特性有关。3.4力学性能检验用0.3M的NaCl溶液重复浸泡菌丝后,提取液中蛋白酶活力见图5。图5表明:尽管盐可以使蛋白酶很快从菌丝表面释放出来,表现在第一次浸泡时有大量的酶被洗脱下来,但剩余的酶需要反复的洗脱,总酶活力为第一次浸泡液中酶活力的180%。3.5超声波破碎前后各保鲜液中的酶活力水重复提取后盐提取及超声波破碎提取后,提取液中蛋白酶活力见图6。用非离子溶液水重复提取菌丝胞外蛋白酶3次后,提取液中酶活力几乎为0,但当再次用盐提取时,提取液中又有酶活力出现(见图6),酶活力为第一次提取液中酶活力的26.5%,表明这部分菌丝表面蛋白酶只能在离子溶液中释放,这与2.3.3中的结论是相吻合的。将反复提取蛋白酶后的菌丝在盐溶液中进行超声波破碎处理,离心后的上清液中酶活力为破碎前提取液中酶活力的3.6倍,为第1次水提取液中酶活力的95%;在水溶液中超声波破碎后,提取液中酶活力是破碎前的3.0倍,为第1次水提取液中酶活力的79%。因此,雅致放射毛霉存在较高的胞内蛋白酶或与菌丝牢固结合的膜酶活力,超声波破碎后,NaCl盐溶液和水都可以将其释放出来,其中以盐溶液的释放效果较好。4胞外蛋白酶释放时间雅致放射毛霉固态培养时,可以产生胞外及胞内(或膜)蛋白酶。其中,胞外蛋白酶是松散结合在菌丝上的细胞表面酶,离子溶液和非离子溶液都可以将其释放,但