枯草芽孢杆菌产淀粉酶菌株的筛选

枯草芽孢杆菌产淀粉酶菌株的筛选

淀粉酶是碳水化合物和糖原酶的总称。它可以脱水并生成各种脱水产物，包括糊精，并逐渐生成由葡萄糖单位组成的聚合物。微生物的许多种类都能产生淀粉酶,枯草芽孢杆菌是其中主要生产菌种之一。淀粉酶是最早实现工业化生产,迄今为止用途最广、产量最大的酶制剂品种。特别是20世纪60年代以来,由于酶法生产葡萄糖以及用葡萄糖生产异构糖浆的大规模工业化,淀粉酶的需要量越来越大,几乎占到整个酶制剂总产量的50%。目前淀粉酶被广泛应用于多个领域,因此,做好淀粉酶活性测定工作具有重要意义。测定α-淀粉酶活性的方法有分光光度法、应交扩散法、3,5-二硝基水杨酸法、黏度计法和降落值法。目前,3,5-二硝基水杨酸法是最常用的方法。在大多数测定淀粉酶的实验和标准中,都是采用常规的方法和步骤,试剂用量较大,且操作过程不够简便。本实验选用的产淀粉酶菌株是实验室保存的枯草芽孢杆菌,经过平板分离、点种、碘熏蒸,筛选出淀粉产酶活性较高的菌株;通过常量和微量两种方法分别测定淀粉酶活性,并对测定结果进行比较分析,希望可以提供一种能够代替常量测定的经济、有效、简便的方法。1材料和方法1.1材料表面1.1.1来源：蘑菇实验室试管保存的枯草芽孢杆菌。1.1.2标糖溶液dmd/l柠檬酸缓冲液(pH6.0),0.4mol/L氢氧化钠溶液,1%淀粉溶液,3,5-二硝基水杨酸(DNS),标准葡萄糖溶液(1g/L)。1.1.3琼脂糖凝胶电泳斜面培养基:可溶性淀粉1%,牛肉膏1%,蛋白胨1%,酵母膏0.2%,氯化钠0.5%,琼脂2%,pH6.5。种子培养基:葡萄糖5%,牛肉膏1%,蛋白胨1.5%,酵母膏0.2%,氯化钠0.5%,pH6.5。发酵培养基:可溶性淀粉5%,牛肉膏1%,蛋白胨1.5%,酵母膏0.2%,氯化钠0.5%,氯化钙1%,pH6.5。1.1.4实验室仪器仪器722N可见分光光度计,101A-2电热鼓风干燥箱,恒温水浴锅,电热恒温培养箱,YPW-Ⅰ型迴转式恒温调速摇瓶柜,80-1离心沉淀器,净化工作台,JA5002电子天平,蒸汽消毒器,电炉,电磁炉等实验室常用仪器。1.2实验方法1.2.1细菌的筛选和保存1.2.1.菌种点种的培养将试管保存的制备枯草芽孢杆菌成菌悬液,分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍,各取1mL涂布于平面上,分别置于37℃恒温箱中培养。在浓度适当的培养基上选取15个菌株,分别编号,转接于试管斜面,于37℃下培养24h,置冰箱保存。然后用接种针分别蘸取每个菌落点种在已经灭过菌的平板上,37℃下培养24h。用碘熏蒸培养皿,在菌落周围出现水解圈,测量水解圈直径与菌落直径并计算其比值(HC比值),作为筛选指标。1.2.1.2.防疫选取酶活性较高的菌株,将冰箱中保存的相应菌株接种于20支试管斜面上,37℃下培养24h,然后保存在4℃冰箱中。1.2.2淀粉酶活性的定量和定量测定1.2.2.培养条件:1从冰箱中取出保存的菌株,转接试管斜面活化,37℃下恒温培养24h。将菌种挑取三环接种到30/250mL种子培养基中,37℃,160r/min,培养12h。用移液管吸取3mL接种到30/250mL发酵培养基中,37℃,160r/min,培养48h。发酵液3500r/min离心10min,去上清液,即为粗酶液。1.2.2.酶促氧化法ph每一个样品4支试管,一个做对照,其他用于测定样品(3个平行样);每管加入酶液1mL,向各管中加入柠檬酸缓冲液(pH6.0)1mL,然后再向对照管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液,以终止其中的酶促反应,各管均是在60℃水浴15min;分别向各试管中加入60℃水浴预热15min的1%淀粉溶液,摇匀,立即放回水浴中,准确保温10min;迅速向各测定管中加入0.4mol/L氢氧化钠溶液,以终止酶促反应。每一步加入试剂的用量见表1。1.2.2.紫外分光光度法提取酶促反应单因素试验和标准液温度待测样:取上述酶促反应液于试管中,加入3,5二硝基水杨酸,沸水浴5min。取出冷却,蒸馏水稀释。利用可见分光光度计测定520nm下的吸光度。其中,常量试剂中,酶促反应液和DNS各2.0mL,稀释至24mL;微量试验中,2种试液分别加入0.5mL,稀释至6mL;标准液:取7支试管,分别加入葡萄糖标准液(1g·L-1),再向各试管中加水定容。然后加入3,5-二硝基水杨酸,沸水浴5min。取出冷却,蒸馏水稀释。利用紫外可见分光光度计测定520nm下的吸光度。标准样常量和微量显色反应的实际用量见表2。1.2.2.粗酶液中葡萄糖含量及酶活力的测定以标准样中葡萄糖含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得到回归方程。将待测样的吸光度代入方程,求得待测样的葡萄糖含量,折算成1mL粗酶液中葡萄糖的含量及酶活力。淀粉酶活力=浓度×体积×1000×稀释倍数/时间。其中,浓度单位为g/L,酶活力单位为μg/min。2结果与分析2.1不同水解圈直径和菌落直径比值筛选了5株产酶活性较高的菌株,分别为枯草6,枯草8,枯草11,枯草13,枯草14,其水解圈直径(H)与菌落直径(C)比值见表3。由表3可以看出,枯草13菌株形成的比值最大,产酶活力较高,因此选定枯草13作为筛选结果。2.2淀粉酶活性常数和定量测定结果2.2.1标准曲线的建立以葡萄糖为标准样进行显色反应,常量测定法和微量测定法所测的吸光值及标准曲线的回归方程和相关系数见表4。标准曲线试验方法规定,R2相关系数达到0.99的回归方程才可使用。从表4可以看出,采用常量和微量试验方法建立的标准曲线,其相关系数均在0.99以上。说明采用微量法获得的标准曲线是可以利用的。2.2.2测定总淀粉酶活力y=1.416x-0.054(R2相关系数为0.999)y=1.374x-0.054(R2相关系数为0.999)以每个样品3次重复为样品,做3个平行。对其进行淀粉酶活性测定。具体实验结果见表5和表6。常量、微量法测定的酶活力比较见表7。由表7无法确定测定方法的差异,因此对两种方法所测酶活力进行方差分析,见表8。由表8可以看出,F=0.77<F0.05=4.49,说明两种测定方法之间不存在明显差异,同时也可以