snp标记的应用与发展

snp标记的应用与发展

0snp标记和ssr标记的发展历程近年来，随着现代药理和分子克隆技术的发展，遗传标记已发展为学术标记、细胞标记和生化标记的新水平。由于个体间的差异实质是个体间基因型的差异,DNA分子标记能够直接反映DNA分子水平上的差异,再加之其多态性高、数量多,且标记表现为显性或共显性,因而其理论与应用价值不可估量。在众多的分子标记中,SNP(singlenucleotidepolymorphism)标记是当前遗传标记研究中最多,也是最有前景的分子标记。自1994年SNP作为一个新的学术术语诞生于人类分子遗传杂志以来,便很快被同行学者接受。1996年Lander正式指出SNP开启了新的分子标记时代,是继以SSR、ISSR为代表的第二代分子标记技术基础上发展起来的第三代分子标记技术。从1998—2002年,每年都召开一次关于“SNPs与复杂基因组”的国际会议,其主旨在于探讨SNPs在复杂基因组研究应用中的前景,其内容包括SNP标记的理论、方法与应用,在此期间每次会议都会在原有基础上增加新的内容。SNP标记作为目前最具发展潜力的分子标记,因其在基因组中数量多、分布广且在基因分析过程中不需要根据片段大小将DNA分带,即可实现大规模高自动化,因而更适合于数量庞大的检测分析,已被广泛应用于生物、农学、医学、生物进化等众多领域。鉴于SNP标记研究发展迅速,因而及时总结其最新研究概况及其发展中存在的问题对今后的研究大有裨益,故笔者详尽介绍了SNP标记的定义及特点,同时简要概述了SNP的检测及分型方法,并对SNP分子标记在Bin图谱构建、高通量芯片分型以及群体进化等3个方面的应用概况进行介绍,以期为SNP标记的理论研究及开发应用提供借鉴。1snp的动态单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)主要是指由于单个核苷酸的变异而引起基因组水平上的DNA序列多态性,形式包括单碱基的缺失、插入、转换及颠换等。一般而言,上述形式中最少1种等位基因在群体中的频率不小于1%,但在某种特殊情况下(如cDNA中)也可以小于1%。1个SNP在基因组某个位点上有单个核苷酸的变化,主要由两种形式出现:一种是单个碱基的转换所引起,即以一种嘧啶置换另一种嘧啶或一种嘌呤置换另一种嘌呤;另外一种形式就是颠换,即嘌呤与嘧啶互换。从原理上分析,突变处的碱基可以是C、G、A、T,而实际上SNP多发生在T和C之间。在生物体的任何地方都可以找到SNPs,根据它们在基因组分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因间SNPs(iSNPs)和基因周边SNPs(pSNPs)等三类。由于cSNP在外显子内的变异率仅为周围序列的1/5,因此数量相对比较少,但它在生物育种和医学遗传病的研究中具有重要意义。根据对生物遗传性状的影响,也可将SNP分为蛋白编码SNP和非蛋白编码SNP,其中蛋白编码SNP位于转录序列中,非蛋白编码SNP位于非转录序列。在蛋白编码SNP中,如果不引起所编码氨基酸序列的改变,则称为同义蛋白编码SNP,否则称为非同义蛋白编码SNP,往往影响相应蛋白质的功能。2symp的特点2.1遗传稳定性高相比串联重复微卫星等多态性标记,SNP是基于单核苷酸的突变,突变频率较低,遗传稳定性相对较高。2.2snp标记的平均密度和频率SNP标记广泛分布于动植物基因组中,且数量巨大,据估计人类基因组大约平均每1000bp就会出现1个SNP,这样在整个基因组的分布就多达到300万个;在其他哺乳类动物中SNP的频率为每500~1000bp出现1次;在水稻中,SNP在亚种内的品种间也有较多的分布,如Nasu等分析了3个粳稻品种、2个籼稻品种和1个野生稻之间SNP的发生频率,对6个材料两两比较,发现每232个碱基存在1个SNP。在玉米基因组中,SNP标记的平均密度为大约57bp出现一个SNP;在大豆基因组中,SNP标记的平均密度约为272bp出现1个SNP。Kanazin等在对5个大麦品系的54个基因进行研究时发现,大麦的38个基因中存在112个SNP。2.3个体性状遗传机理部分位于基因内部编码区的SNPs可能导致蛋白质功能的改变,这种改变可能是生物体发生变异或者病变的直接原因,因此有可能为个体性状遗传机理研究提供一定的参考依据。2.4snp标记的构成在动植物群体中,SNP标记可能由2个、3个或4个等位基因构成,但实际上后2种情况出现的机率异常少见,常被忽略。SNP标记一般只有2种等位型的碱基组成,具有二态性;由于具有等位基因性,因而在任何种群中其等位基因频率都可估计出来。2.5snp分型检测技术总体而言,SNP与RFLP、STRs等传统的DNA标记差异甚大。在开发检测技术上,过去一般是建立在凝胶电泳基础上对多个个体进行分析的方法,步骤比较繁琐,速度相对较慢,价格又较贵。而SNP基于自身的双等位标记这一特点,在检测样品时无需像检测RFLP、SSR标记那样测量片段的长度,而是通过测序直接进行序列比对来发现差异。因此SNP在技术上有着较大的比较优势,可以摆脱电泳分型的瓶颈,加上近年来各种新兴的技术层出不穷,提高了自动化检测水平,也提高了检出率,因而促进其快速发展。另外,由于SNP自身具有密度高、分布广等特点,又加上先进的高通量SNP检测系统的研制,SNP标记将对未来生命科学领域产生重大的影响。但是,高通量SNP检测技术,并非任何时候都适用,如对作物的SNP进行分析鉴定和利用时,由于涉及到作物个体数量较大,通常会以群体的形式来进行研究分析,对某一特定区段里面的SNP位点需要同时检测很多个体,对众多的个体都进行高通量测序显得很不切合实际,因此需要不同的SNP分型方法来进行检测。依据分子生物学原理,绝大多数的SNP分型实验分为4类:等位基因特异性杂交、引物延伸法、寡核苷酸连接反应和内切酶酶切技术。每种分型实验的产物又可以有几种不同的检测方法,如:冷光法、荧光法、质谱法等。按SNP分型量通量的大小可分为高通量的SNP芯片法、中等通量的SNP分型方法(质谱法、SnaPshot、高分辨溶解曲线分析法)、传统的低通量SNP分型方法(测序法、限制性内切酶酶切法和两轮PCR特异引物法)。3全基因组水平分子时代随着现代生物技术的发展,许多动植物基因组测序已经完成,分子遗传育种进入高通量、大规模的全基因组水平分子时代。由于SNP分子标记分布广泛又加上其多样性高、数量大等特点,故受到系统进化研究者和分子育种家们的高度重视,并已经成为生命科学研究领域的一个不可或缺的工具。3.1选择高精度和定量、思维方式的ssr/rflp-pcr检测取一定数量的连续SNP标记作为判断染色体重组事件的最小单位(recombinationbin),判断子代每个bin来源于父母本的情况,得到每个子代的全基因组物理图谱,从而构建出的遗传图谱称之为Bin图谱。Bin图谱主要用于后续高精度遗传连锁图谱构建和QTL定位。随着生物技术的进一步发展,Bin图谱被称为继基于SSR/RFLP标记的传统遗传图谱之后新一代遗传图谱。相比基于SSR/RFLP标记的传统遗传图谱,Bin图谱的优势在于:(1)构建时间短、图谱精确度要高于传统遗传图谱。如Yu等应用全基因组重测序对241株水稻RILs群体进行~0.06X低深度测序,以SNP为基础构建Bin图谱,与传统的基于SSR/RFLP构建的图谱相比,Bin图谱具有超高密度,能够检测到更多的QTL,同时检测到的QTL也更加精细。基于SSR/RFLP标记的传统遗传图谱精度约为1~10Mb,由于标记密度限制,可能漏测某些双交换位点,而Bin图谱却可以避免这种情况发生,它的精度约为100kb,可全基因组扫描所有的重组位点;(2)在构建方式上,Bin图谱是高通量测序,自动化程度高,效率高,而后者是实验室电泳,工作量大、繁杂。Bin图谱主要用来构建高精度遗传图谱和QTL精细定位,适用于有参考基因组且基因组已组装到染色体水平的物种,如:在水稻开发研究方面,Huang等将2个水稻亲本与其构建的150株RILs群体进行测序,发现1493461个SNPs的位点,最终构建成全长1539.5cM的Bin图谱。Xu等通过对水稻亲本9311的高深度测序和128个CSSLs的低深度的重测序,构建了一张高密度的Bin图谱,检测到了768万个SNP位点,这128个CSSL携带了259个染色体代换片段,利用这张图谱,成功地定位到了第1号染色体上的791655bp范围之内一个重要的QTL,这段范围包括了著名的“绿色革命”sd1基因;在苹果SNPs标记研究开发方面,Han等用BESs的方法,即以候选SNPs为基础构建的Bin图谱用于整合物理和遗传图谱构建苹果的遗传图谱,采用此方法成功地探测和开发了从228个BESs中检测出的53个SNPs,这些标记固定了51个片段重叠群,累积物理长度大达37Mb,分布在14个连锁群上。其他作物也有过类似的研究报道,如:吴玲等基于玉米基因定位中SSR标记密度不够,一般的SNP标记只基于2种基因型序列差异而在检测其他基因型材料时多态性不够的局限性,因而采用从公共数据库下载不同遗传背景的玉米表达序列标签,结合生物信息学软件开发基于EST序列的高多态性SNP标记,最终在全基因组中发掘出了80363个SNP位点,进而开发出了12388个SNP标记,这些SNP标记具有高度多态性。此外,在动物果蝇、猪等方面也有研究报道,如:黄生强利用SNP标记在猪的第4号染色体上定位到PHI、PHU、背膘厚、屠宰重量等数量性状QTL,同时还将DECR1基因SNPs与猪的经济性状进行相关分析。3.2基因芯片技术新型的SNP检测技术,在样品检测时不像第二代分子标记那样必须借助凝胶电泳对各位点进行分型,而是直接以序列的差异作为标记,具体做法是通过SNPs与固体表面的靶标结合而不是基因组序列,这样可使多达10000个个体的DNA固定到一张芯片上分析,体现了基因芯片的优势:高通量、高集成、微型化和自动化。目前华大基因拥有的IIIuminaSNP分型技术(包括Infinium®和GoldenGate®技术)是目前世界上在农业领域应用得较多的基因分型技术之一。以GoldenGate为例,一次可以同时检测102~106个SNP位点,平均每天可以完成上千个样品的基因分型,其再现性大于99.9%,孟德尔遗传错误率小于0.1%。3.2.2gs3和gw5基因Settles等利用全基因组分型芯片进行了奶牛副结核病易感关联位点研究。Yu等利用高密度的SNPs图谱进行全基因组扫描,检测到与稻米米质相关的粒型粒重基因GS3和GW5基因;另外一些与产量相关的基因(如分蘖数、每穗粒数、千粒重)也被检测到。3.2.3染色体区域的选择Barendse等报道了SNP分型数据可用于群体选择分析,用来比较不同群体,从而寻找一些在进化或者驯化过程中受到选择的染色体区域。3.2.4全基因组的选择等方面朱沂等利用全基因组SNP芯片筛查2型糖尿病患者大血管病变易感基因,最后利用PLINK软件对芯片结果进行全基因组关联分析,结果筛选到452个SNP位点在处理组和对照组间存在显著差异,其中37个位点位于T2DM大血管病变主要代谢通路相关基因内或其附近,并通过这些位点锁定了30个大血管病变易感基因。3.3snp研究方法SNP作为新一代的分子标记,具备充足的信息进行基因连锁分析和与动植物DNA功能性变异密切相关的连锁不平衡分析。通过全基因组测序,对不同群体的SNP图谱进行分析比较,或者基于SNP进行关联遗传学分析就可以获得群体起源、迁移、遗传、漂变等方面的信息,进而阐明群体的进化历程。Claiborne等通过对人类313个基因中的3899个SNP进行单体型变异研究,并在此基础上进行连锁不平衡分析,研究结果支持了人类群体在近代扩张的假说。González-Martínez等采用SNP方法对火炬松erd3基因进行分析,结果表明火炬松erd3基因可能经过了一定的快速定向选择进化过程,因为其基因ccoaoml-1以二态性的形式存在。Xia等通过对29只家蚕和11只野蚕进行重测序,得到40只蚕的进化关系,应用系统进化分析,发现所有野蚕群体聚成一组,家蚕群体分成了3组,并开发出数百万个SNP分子标记,找到了可能与驯化相关的重要基因区域。Lam等应用新一代测序技术对17株野生大豆和14株栽培大豆进行全基因组测序,平均每个个体测序深度5X左右共发现了SNP超过630万个,建立了高密度的分子标记图谱,构建了31株大豆的系统进化树,并进行了主成分分析和群体结构等研究,此外该研究还鉴定了205614个标签SNP可供QTL定位及关联分析。4snp标记的研究现状由于SNP具有多态性丰富、在作物基因组中分布密度大、富有代表性,又加上检测速度快等特点,在生物领域具有广阔的应用前景和发展潜力。随着生物技术的飞速发展,人类对SNPs的发现、描述及其在确定表现型中的成功应用标志着一个新里程碑的出现。虽然SNP作为新一代的遗传标记为人类遗传学、分子遗传学、药物遗传学、法医学以及疾病的诊断和治疗等方面的发展带来了更加广阔的前景,但就目前而言,全基因组SNP标记的开发策略仍赖于基因组草图搜索法,即通过基因组不同染色体的测序结果发现SNP位点,这种开发策略只能应用于少数动植物中,再加上SNP标记的开发费用仍相对过高,这在很大程度上制约了SNP技术的应用。在畜