血红蛋白的提取和分离(shk)

血红蛋白的提取和分离

学习目标

简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。1、主要概念：①凝胶色谱法②电泳法③缓冲溶液④它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。2.主要原理：①凝胶色谱法分离蛋白质的原理②电泳法分离样品的原理③缓冲溶液的组成和作用机理3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法

4、课题难点：①样品的预处理②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成这标志着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。如何从复杂的细胞混合物中提取，分离高纯度的蛋白质呢？思考1分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。思考2蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。你认为分离蛋白质和分离DNA一样容易吗？思考3人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。提取分离方法凝胶色谱法

凝胶电泳法分离蛋白质的方法：一、基础知识㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：

1、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类化合物构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）

2、概念：根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。4、具体过程相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。㈡缓冲溶液：

2、作用：

能够抵制（）对溶液的（）的影响，维持PH基本不变。外界的酸或碱PH值3、缓冲溶液的配制通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。1－2使用比例在不同PH范围内

思考：说出人体血液中缓冲对。

NaH2PO4/Na2HPO4H2CO3/NaHCO3㈢电泳：1、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。思考：在整个实验过程中使用的缓冲液是什么？它的目的是什么？使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。

2、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有)在()下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（

），从而实现样品中各种分子的分离。多肽、核酸可解离的基团正电或负电所带电荷相反的电极带电性质的差异大小形状迁移速度

一定的PH（1）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵和催化剂（四甲基已二胺）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶

3.分类：两种常用的电泳方法:琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。（2）原理为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入()。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是()。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于()。

（3）SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理:单条肽链的分子量分子的大小SDS注意：测定（）通常用十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳蛋白质相对分子质量聚丙烯酰胺凝胶电泳对分离大分子具有较高的分辨率，但核酸比蛋白质分子大得多，只能采用较大孔径的琼脂糖凝胶电泳。核酸分子本身含有大量的磷酸根，核酸带负电荷，在电场中向正极移动。溴化乙啶荧光染料对核酸染色在紫外线的照射下，发出橙红色荧光。根据荧光条带的粗细和分布的位置，可以用在对PCR扩增效果的鉴定上。

说明：电泳检测PCR结果琼脂糖凝胶电泳二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

1.样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到血红蛋白溶液。

2.粗分离：透析除去分子较小的杂质。

3.纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

4.纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

F:\生物技术实践视频\高中生物选修1实验电影血红蛋白的提取和分离.flv二实验操作1.样品处理和粗分离血液血浆水分其他物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（

）两个a－肽链两个β一肽链共四条肽链90％每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。①目的：去除（）②方法：（

）离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的（），将下层（）的红细胞液体倒入（）每个肽链环绕（），此基团可携带（）。血红蛋白因含有（）而呈红色。本课题可选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液来分离血红蛋白。一个亚铁血红素基团一分子氧或一分子二氧化碳血红素(1)红细胞的洗涤杂质蛋白低速短时间黄色血浆暗红色烧杯再加入用（）的（）质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤,缓慢搅拌10min，（）离心.五倍体积生理盐水低速短时间如此重复洗涤（）次，直至上清液中已没有（），表明洗涤干净。利于后续血红蛋白的分离纯化，不可洗涤次数过少。三黄色洗涤过程图解血液100mL3g柠檬酸钠低速离心2min红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色(2)血红蛋白的释放

加（）到（）体积，再加40％体积的（）（溶解细胞膜），置于（

）上充分搅拌10min（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白.(3)分离血红蛋白溶液

将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min，试管中的溶液分为4层:原血液甲苯磁力搅拌器蒸馏水第1层（最上层）：（

）甲苯层第2层（中上层）：（）色薄层固体，（

）的沉淀层。第3层（中下层）：（

）的液体，（

）的水溶液层。

第4层（最下层）：其它杂质（）的沉淀层无色透明脂溶性物质白血红蛋白红色透明暗红色用

过滤，除去

，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。滤纸脂溶性沉淀层分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管滤纸过滤脂溶性沉淀物烧杯取()ml的血红蛋白溶液装入（

）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/L的（）中，pH为（），透析12小时，目的是

（）或用于更换样品中的（）。透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。除去样品中分子量较小的杂质透析袋磷酸缓冲液7.0缓冲液(4)透析（粗分离）1小结：样品处理和粗分离1、红细胞的洗涤：目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水洗涤。2、血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放3、分离血红蛋白溶液：离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出红色透明液体。4、透析：装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。去除小分子杂质。2.凝胶色谱操作----(1)凝胶色谱柱的制作(2)凝胶色谱柱的装填(3)样品的加入和洗脱血红蛋白的纯化⑴凝胶色谱柱的制作：注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。材料：交联葡聚糖凝胶G-75；20mmol/L磷酸缓冲液装填:(2)凝胶色谱柱的装填：立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h洗涤平衡一次性缓慢倒入；轻轻敲打装填悬浮液凝胶颗粒＋洗脱液→沸水浴凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀根据色谱柱体积计算凝胶用量色谱柱垂直固定在支架上配制悬浮液计算称量凝胶固定色谱柱(3)样品的加入和洗脱①调节缓冲液面②滴加透析样品注意：正确的加样操作是：1.不要触及并破坏凝胶面。2.贴壁加样。3.使吸管管口沿管壁环绕移动。③样品渗入凝胶床

④洗脱

⑤收集注意：在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）判断（）的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。纯化知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法

原理

分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定影响蛋白质分子运动的因素√√√√√√√观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。三实验结果分析与评价1、是否完成对血液样品的处理由于凝胶是一种半透明的介质，