15种鸟类线粒体cyb和co基因序列变异及系统发生

15种鸟类线粒体cyb和co基因序列变异及系统发生

鸟科类是现存鸟类中种类最多、发展地位最高、适应性最广的分类群体（hallingietal.，1997）。传统的分类方法只根据形态和行为特征进行分类。然而，由于该群体的形态和行为特征复杂，一些群体很难区分。因此，有必要对传统的分子标记进行新的分子分类方法进行补充。在线粒体DNA中,细胞色素b(Cytochromeb,简写为Cytb)基因已被应用于雀形目的亚科及鸫亚科的系统演化关系和分类地位的研究(姜海英等,2000;潘巧娃等,2006;Seiboldetal.,1996;Sheldonetal.,1999)。线粒体DNA中的细胞色素C氧化酶亚单元(cytochromeoxidasesubunitⅠ,CoⅠ)基因是DNA条形编码选用的主要基因之一,DNA条形编码可利用简短的标准化DNA片断(648bp)对物种进行鉴定(Hajibabaeietal.,2006),因此对于分类学家来说是十分有益的工具(SchindelandMiller,2005;肖金花等,2004),已经被广泛地应用于动、植物的物种鉴定(Hebertetal.,2003,2004),国内尚未见到对鸟类的相关报道。本文通过对Cytb基因全序列(1143bp)和CoⅠ基因部分序列(1176bp)的各碱基含量、转换与颠换比率、变异位点的数量及其与总位点的比率、简约信息位点的数量及其与变异位点的比率、碱基替换的饱和度及遗传距离进行了比较分析。在PAUP4.0中使用邻接法、最大似然法、最大简约法以及贝叶斯推论法构建了雀形目6科15种鸟类的系统发生树,对两种分子标记所构建的各系统发生树的拓扑结构进行了比较。在此基础上对CoⅠ基因作为鸟类分子标记的可行性进行了分析,旨在为雀形目鸟类的DNA编码识别、分类研究以及探讨可能的系统演化关系提供新的研究手段。1材料和方法1.1鸟类选取及数据收集本实验共使用了24个样品,均为2003～2004年从野外采集的肌肉(紫翅椋鸟为血液样)样,代表了雀形目6科15种鸟类(表1)。为确保数据的准确性,大多数物种选用了2例个体。此外,有1例个体和外群的序列来自GenBank。1.2方法1.2.1动物基因组的提取取无水乙醇浸泡、-20℃保存的组织样品30mg,按照上海生工生物技术有限公司的SK1205动物基因组DNA抽提试剂盒中的说明步骤,进行总DNA提取。提取过程中均以灭菌滤纸代替样品作阴性对照,以检测是否有外源DNA的污染。1.2.2引物和pcr扩增PCR扩增所用引物为CoⅠ基因的通用引物L6615(5′-CCTCTATAAAAAGGTCTACAGCC-3′)、H7539(5′-GATGTGAAGTATGCTCGAGTGTCTAC-3′)和H7956(5′-GGGTAGTCCGAGTATCGTCG-3′)(Mirandaetal.,1997;Mindelletal.,1991);扩增Cytb基因的引物为L14731(5′-AATTGCATCCCACTTAATCGA-3′)、H16064(5′-CTTCAATCTTTGGTTTACAAGACC-3′)(Saetreetal.,2001;Sorenson,1999)及本文自行设计的引物LB1(5′-TACCTGGGTTCCTTCGCCCT-3′),其中H和L分别代表重链和轻链。所有引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成,可特异地扩增鸟类线粒体DNA的CoⅠ基因(1176bp)和Cytb基因(1143bp)。PCR扩增反应体系总体积为50μl,其中含有10×buffer5μl、25mmol/LMgCl225μl、TaqDNA聚合酶0.5U、2mmol/LdNTP5μl、10mol/L的引物各2μl、DNA模板约为100ng。反应程序为:95℃预变性4min、95℃变性45s、44～52℃退火60s、72℃延伸1min,35个循环,循环结束后72℃延伸2min。PCR扩增过程中也设置了空白对照,以确保实验过程中不受外源DNA分子的污染。1.2.3凝胶成像仪扫描扩增得到的PCR产物,首先用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,紫外分析扩增产物并用凝胶成像仪扫描。其次对于扩增效果好的样品,用H.Q.&.Q.凝胶回收试剂盒Ⅱ回收扩增产物。最后将回收后的产物再经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测后效果好的样品直接送往上海生工生物工程技术有限公司,利用ABI3730遗传分析仪进行双向测序。1.3系统发育数据的构建测序结果用CEXpress软件进行拼接并辅以手工校正,校正结果首先用ClustalX1.83软件(Thompsonetal.,1997)进行比对,然后在NCBI中用BLAST进行相似性搜索,以确保得到的CoⅠ和Cytb基因序列是本研究的目的序列。由于同种个体之间的序列差异很小(0～0.003),因此大多数物种选用1例个体代表该物种来进行分析。2例棕背伯劳Laniusschach间的遗传距离是同种不同个体间遗传距离最大的(0.003)物种,2例紫翅椋鸟Sturnusvulgaris分别采自亚洲和欧洲,将以上两物种的2例个体均保留了下来,因此文中用17个样本代表了雀形目6科15种鸟类。最后使用ClustalX1.83软件对确定后的序列进行比对和排序,以科级阶元为单位对两个数据集进行分组,再用MEGA3.0(Kumeretal.,2004)软件分别计算比较了两种标记序列的碱基组成和各科之间的遗传距离,科内、种间、种内的遗传距离和不同序列间的碱基变异位点、简约信息位点、转换与颠换平均比率及各个碱基的平均含量。此外,根据外群的选取原则和实验所拥有的样本情况,本文选择了红喉潜鸟Gaviastellate和短尾圆嘴鹱Pterodromabrevirostris作为外群分别构建系统发生树。在重建系统发生关系之前,首先对数据进行了系统发育信号强弱的检测,以判断所得序列是否具有系统发育分析的信号及强弱,使用PTP(Permutationtailprobability)检验进行信号检测。建树方法采用PAUP4.0(Swofford,2000)中的最大简约(Maximumparsimony,MP)法、最大似然(Maximunlikelihood,ML)法及邻接(Neighborjoining,NJ)法分别构建MP树、ML树和NJ树,其中NJ树和MP树各分枝的自举值经1000次重复检验,ML树采用100次自引导法重复检验。使用MrBayesV3.1(RonquistandHuelsenbeck,2003)软件构建贝叶斯(Bayesian)树,运行500000代,每100代存1次树,其各分支的置信度通过后验概率来评价。2结果和分析2.1碱基的基因组化和转换编码基因的基本信息,见表3。云用PAUP4.0软件对Cytb和CoⅠ基因间不一致水平进行了PHT(Partitionhomogenetytest)检验,表明两基因水平差异显著(P=0.001,P<0.01),因此不能将这两组数据整合在一起进行分析。采用MEGA3.0对雀形目6科15种鸟类(不含外群)的Cytb和CoⅠ基因序列分别进行了分析,计算出了各科之间的遗传距离(表2),并分别统计两个数据集转换/颠换的平均值。不含外群时,在Cytb基因序列(1143bp)中共有变异位点454个,占总位点数的39.7%;简约信息位点337个,占变异位点数的74.2%,占总位点数的29.5%;转换/颠换是1.492;碱基A、T、C、G的平均含量分别为29.4%、24.5%、32.9%、13.2%。在CoⅠ基因序列(1176bp)中共有变异位点366个,占总位点数的31.1%;信息简约位点303个,占变异位点的82.7%,占总位点数的25.8%;转换/颠换是1.604;碱基A、T、C、G的平均含量为27.7%、25.5%、29.4%、17.4%。比较以上两组数据后可以看出:1)CoⅠ基因序列的碱基变异百分比略低于Cytb基因,但前者的简约信息位点占变异位点的百分比略高于后者;2)碱基组成百分比都显示出G的含量相对缺乏,C的含量相对丰富;3)碱基的替换均以转换为主。在以上3个差异中,后两个差异在其它鸟类研究中也有报道(LovetteandBermingham,2000)。Cytb和CoⅠ基因序列的密码子第3位点发生碱基替换的频率均较高,其中第3位点转换数和颠换数分别占其发生总数的76.2%和89.4%,这是由于密码子第3位点在进化中承担的压力较小,其替换多属于同义替换,较少引起氨基酸的取代。为了进一步估计两个数据集碱基替换的饱和程度,以未校正的遗传距离为横坐标、颠换和转换为纵坐标做了饱和度分析散点图(图1～2)。由图1～2可以看出,Cytb和CoⅠ基因序列的转换数明显高于颠换数;Cytb和CoⅠ基因序列间的遗传距离分别相对集中在0.15～0.18和0.12～0.16之间;除CoⅠ基因序列颠换外,Cytb和CoⅠ基因序列的替换数在达到最大值后仍呈现出明显的上升趋势,即两者的碱基替换均未达到饱和状态。2.2cybt和co基因序列的遗传距离为了进一步分析CoⅠ基因在鸟类物种鉴定方面的可行性,本文将椋鸟科的紫翅椋鸟分为一组、椋鸟科其它鸟类分为另一组,伯劳科的棕背伯劳与红背伯劳各为一组。在MEGA3.0中分别计算了紫翅椋鸟、棕背伯劳的组内(种内)和组间(种间)的遗传距离(表3)。由表3可知,Cytb和CoⅠ基因序列在棕背伯劳与红背伯劳之间的遗传距离为分别0.075、0.065,棕背伯劳种内的遗传距离为0.001、0.003。Cytb和CoⅠ基因序列分别在紫翅椋鸟与椋鸟科其它物种间的遗传距离为0.099、0.096,紫翅椋鸟种内的遗传距离为0.018、0.014。除棕背伯劳种内的遗传距离外,由Cytb基因计算出的各遗传距离均比由CoⅠ基因计算出的大,即Cytb基因序列在种内、种间的差异比CoⅠ基因的更为明显。由Cytb和CoⅠ基因序列分别计算出的椋鸟科种间、种内遗传距离的比值为5.50、6.86,说明CoⅠ基因在种间、种内遗传距离的比值较Cytb基因的大。2.3不同cybt基因构建的层析成分模型在PAUP4.0中,对Cytb和CoⅠ基因的两个数据集分别进行了PTP检验,结果P值为0.0001,即表示能找到与限制树(Constrainttree)一样短或比其更短的树的概率只有0.0001,表明数据集均具有非常显著的系统发育信息,而不是随机数据。同时,还对两个数据集分别进行了碱基组成偏向性的χ2检验,结果显示数据组的碱基组成均具有偏向性,因此,在构建NJ树时对两个数据集都进行了Logdet转换。当转换/颠换小于2.0时,一般认为该基因序列的突变已经达到饱和状态,受进化噪音影响的可能性较大,重建系统发生树时需要进行特别的加权(KnightandMindell,1993)。本文中Cytb和CoⅠ两基因序列的转换/颠换分别约为1.5和1.6,均小于临界值2.0,所以在最大简约法分析时根据Kimura双参数估计转换/颠换,对两个数据集分别进行了颠换/转换加权(R值分别为1.5和1.6)和密码子加权(密码子第1、2、3位点分别赋予2、4、1,2、6、1的权值),MP树各参数见表4。构建ML树时,Cytb和CoⅠ基因选用的模型分别来自Modeltest3.06中机选产生的最佳核苷酸替换模型(TVM+I+G)和(GTR+I+G),模型各参数见表5。从图3可以看出,基于Cytb和CoⅠ基因两组数据集并采用相同方法所构建的系统树中,科级阶元各分支的构成是基本相似的,但也存在着一定的差异。具体来说,用Cytb基因构建的NJ树(图3-A),首先分化出黄鹂科,接着平行的分化出卷尾科、鸦科及伯劳科的分支和椋鸟科、河乌科的分支,其中卷尾科和鸦科相聚后再与伯劳科聚为一支;用CoⅠ基因构建NJ树(图3-B),卷尾科的分支与鸦科和伯劳科形成的分支、黄鹂科和河乌科相聚后与椋鸟科形成的分支构成并列的3个支系。基于Cytb基因构建的密码子加权、颠换/转换加权MP树的科级分支基本相同,卷尾科、鸦科、黄鹂科3个支系和伯劳科、河乌科与椋鸟科依次形成的支系构成4个并列支系;基于CoⅠ基因构建的密码子加权MP树、颠换/转换加权MP树、ML树(图3-D),各科的分支关系与用CoⅠ基因构建的NJ树各科分支关系完全相同。基于Cytb基因构建的ML树(图3-C)、Bayesian树各科的聚类关系完全相同,依次分化出黄鹂科、卷尾科、鸦科、伯劳科、河乌科和椋鸟科;用CoⅠ基因构建的Bayesian树(图3-E)中内群分为2大支系,其各科的分支关系与图3-B的相似,只是卷尾科和黄鹂科、河乌科和椋鸟科分别形成的支系再聚为一支。此外,在以上几类系统发生树的基础上,分别构建了Cytb和CoⅠ基因两个数据集的50%合一树(图3-F),在基于Cytb构建的各系统树的合一树中,各科的聚类关系与图3-C的相似,只是黄鹂科较其它几科先分化出来;在基于CoⅠ构建的各系统树的合一树中,各科的聚类关系与图3-B中的完全相同。从以上分析可见,由Cytb和CoⅠ基因构建的各科系统发生树对雀形目科级阶元间系统发生关系的解析尽管存在一定差异,但基于CoⅠ基因构建的系统树中科级阶元的聚类关系比Cytb的稳定。用Cytb和CoⅠ基因两组数据所构建的各系统树中,椋鸟科7种鸟类首先分化出紫翅椋鸟,接着分化出并列的2个支系:第1支由互为姐妹群的黑领椋鸟和北椋鸟组成,第2支系由灰背椋鸟、灰椋鸟、八哥和丝光椋鸟组成,其中第2支系内依次分化出灰背椋鸟、灰椋鸟、八哥和丝光椋鸟。由此可见,基于Cytb和CoⅠ基因分别所构建的系统树,对椋鸟科7种鸟类的系统发生关系得到了一致的解析结果,两种分子标记均能很好的解析科内的系统发生关系。3co基因对雀形目物种鉴定的影响肖金花等(2004)认为,CoⅠ基因自身既有足够的变异位点、容易被扩增,又有蛋白编码基因所共有的特点(即密码子第3位碱基不受自然选择压力的影响,可以自由变异,而且其DNA序列本身很少有插入和缺失)。本文分析了内群15种鸟类的CoⅠ基因序列,表明其有变异位点366个,占总位点数的31.1%;信息简约位点303个,占变异位点的82.7%,而且在序列中没有发现插入和缺失,该结果说明了CoⅠ基因能够为重建鸟类系统发育关系提供足够的信息简约位点。此外,StoeckleandHebert(2004)在研究了北美130种鸟类CoⅠ基因序列(648bp)后发现,这些鸟类的种间差异是种内差异的18倍。本研究分别分析了伯劳科2种3个样本和椋鸟属6种7个样本的CoⅠ基因(1176bp)序列后表明,棕背伯劳的种内遗传距离为0.3%,它与红背伯劳之间的遗传距离平均为6.5%,即种间的遗传距离是种内的22倍;同时紫翅椋鸟种内的遗传距离为1.4%,而它与椋鸟属其它种类间的遗传距离为9.6%,即种间的遗传距离是种内的6.9倍;以上分析结果进一步说明了CoⅠ基因序列在雀形目的种间遗传距离远大于种内遗传距离。KrajewskiandFetzner(1994)和Xiangyuetal.(2000)均认为,同属鸟类种间的Cytb基因的遗传距离大于1.0%。本文所用的CoⅠ和Cytb基因在伯劳属种间的遗传距