第2章新 基因工程及其在食品工业中的应用

三）质粒

（plasmid）

质粒是存在于细菌细胞质中独立于染色体而自主复制的共价、封闭、环状双链DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）。

★不是细菌生长所必需的

★可赋予细菌抵御外界因素不利影响的能力

★分子量在1-200kb之间基因工程至少需要3种工具：限制性核酸内切酶——“分子手术刀”DNA连接酶——“分子缝合针”基因进入受体细胞的运载体——“分子运输车”主要从原核生物中分离纯化出来1.1.1来源：1.1.2特点：1.1.3作用：1.1.4结果：具有专一性识别某种特定的核苷酸序列，使特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开形成两种末端黏性末端平末端切开磷酸二酯键1.2DNA连接酶—“分子缝合针”1.2.1作用：恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键E.coliDNA连接酶：连接黏性末端T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端(效率较低)1.2.2种类：形成磷酸二酯键1.3基因进入受体细胞的运载体—“分子运输车”1.3.1常用的运载体：质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等质粒：一种存在于细菌或细胞染色体外的能够独立复制的遗传物质。一般为双链共价闭合环形DNA分子，长度为2-200kb。大肠杆菌及质粒载体结构模式图1.3.2作为运载体所具备的条件：结构小(即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多)对细胞无害能自我复制有标记基因：有多个酶切位点等如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等小结基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有专一性(识别序列)切开DNA分子的磷酸二酯键DNA连接酶连接磷酸二酯键种类E.coliDNA连接酶T4

DNA连接酶运载工具条件结构小而稳定能自我复制具多个限制酶切位点具标记基因等质粒、λ噬菌体衍生物、动植物病毒等基因工程的基本操作程序1、获取目的基因2、构建基因表达载体3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定一、提取目的基因1、目的基因原核细胞基因结构真核细胞基因结构是所要研究或应用的基因，也就是将要克隆或表达的基因或基因的一个片段。获取目的基因是分子克隆中最重要的一步。2、获取目的基因的常用方法（1）从基因文库中获取（2）利用PCR技术扩增（3）人工合成（通过DNA合成仪）基因文库基因组文库部分基因文库如cDNA文库包含了一种生物的全部基因的基因文库叫做基因组文库

将细胞所有mRNA逆转录成cDNA片段，克隆到适当的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，此即cDNA文库。基因组文库与部分基因文库的比较基因文库的构建将总DNA包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。cDNA合成过程

第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。基因组文库将基因组DNA经内切酶消化后插入载体，得到含有不同插入片段载体，这种克隆载体混合物应该含有不同基因组片段，此即基因文库。cDNA文库将细胞所有mRNA逆转录成cDNA片段，克隆到适当的载体中，构建成含有不同cDNA片段的克隆载体混合物，此即cDNA文库。各种组织或细胞的基因组或cDNA文库都可以从公司购买。可用已知有限的信息合成特异性探针，采用分子杂交法从文库中筛选感兴趣的片段。构建基因文库的方法①鸟枪法(直接分离法)②反转录法提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库①鸟枪法(直接分离法)某种生物的mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录②反转录法求异思维你能推测出由mRNA反转录形成cDNA的过程大致分为哪些步骤吗？反转录酶既可以利用DNA又可以利用RNA作为模板合成与之互补的DNA链。像其他DNA聚合酶一样，反转录酶也以5′→3′方向合成DNAcDNA合成过程是：第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。如何从基因文库中得到所目的基因？依据：目的基因的有关信息。如：根据基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色体上的位置基因的转录产物mRNA基因的表达产物蛋白质等特性。①鸟枪法：供体细胞中的DNA许多DNA片段运载体限制酶与载体连接载入受体细胞产生特定性状导入外源DNA扩增目的基因分离(直接分离法)(一)从基因文库中获取目的基因②反转录法：

以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。目的基因的mRNA杂交双链(单链RNA/单链DNA)单链DNA反转录酶核酸酶HDNA聚合酶双链DNA(目的基因)③根据已知的氨基酸序列合成DNA法：

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考:为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?寻根问底1.为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。（2）利用PCR技术扩增目的基因PCR——聚合酶链式反应是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。PCR技术原理：前提：条件：方式：结果：DNA复制一段已知目的基因的核苷酸序列以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）指数2n模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；热稳定DNA聚合酶（Taq酶）等使目的基因的片段在短时间内成快速地扩增

过程变性、退火、延伸三步曲变性：加热至90～95℃氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA退火：冷却至55～60℃引物与模板的单链DNA互补配对结合延伸：加热至70～75℃以目的基因为模板，合成互补的新DNA链变性退火延伸（3）人工合成——根据已知的氨基酸序列合成DNA仅限于合成核苷酸对较少的简单基因蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成（通过DNA合成仪）

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。二、基因表达载体的构建——核心（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。（2）用___________切断目的基因，使其产生_________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量___________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）限制酶黏性末端同一种限制酶切口DNA连接酶相同的黏