uplc-msms法同时测定注射用辛芍冻干粉针中8种成分的含量

uplc-msms法同时测定注射用辛芍冻干粉针中8种成分的含量

射箭注释（冷冻干粉针）是用现代红茶、灯火以及冷冷冻干燥法从现代红茶中提取出来的中药。具有活血化瘀、通经活络的功效，主要用于中风和血瘀阻络证的临床治疗。能迅速改善脑缺血动物的症状,对脑缺血性大鼠及小鼠有明显保护作用;增加大鼠脑血流,改善缺血大鼠脑微循环［1－4］。多成分含量测定方法是中药现代化质量控制的重要手段和趋势。液质联用法由于专属性强、灵敏度高,已经越来越多地应用于中药及其制剂的质量控制研究中［5－6］。为有效控制产品质量,确保本品的临床疗效,采用UPLC-MS/MS法建立了注射用辛芍(冻干粉针)中7个主要成分的含量测定方法,该方法操作简便,快速灵敏,重现性好,为全面准确地控制注射用辛芍(冻干粉针)的质量提供了科学依据。ACQUITYTM系统超高液相色谱-三重四级杆串联质谱仪(包括二元梯度泵、自动进样器、柱温箱、三重四级杆质量分析器和Masslynx4.1质谱工作站,美国Waters公司)。没食子酸(批号:110831-200803)、芍药苷(批号:110736-200934)和野黄芩苷(批号:110842-201106)对照品购自中国食品药品检定研究院;氧化芍药苷(批号:20120310)、芍药内酯苷(批号:S37-100126)、灯盏甲素(批号:20120706)和苯甲酰芍药苷(批号:20120321)对照品购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心;注射用辛芍(冻干粉针,贵州省药物制剂重点实验室提供,规格:200mg/支,批号:20100612,20100620,20100703)。乙腈(德国Merck公司)、甲酸(美国Tedia公司)为色谱纯;水为超纯水;其他试剂均为分析纯。方法和结果1流动相及流场色谱柱为WATERSACQUITYBEHC18柱(50mm×2.1mm,1.7μm);流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液,线性梯度洗脱程序见表1;流速为0.35mL·min－1;柱温为45℃;进样量为1μL。2正负离子同步检测离子源电喷雾电离源(ESI);毛细管电压3.0kV;离子源温度120℃;去溶剂气N2,流速650L·h－1;去溶剂气温度350℃;离子源温度120℃;碰撞气Ar,流速0.18mL·min－1;多反应离子监测(MRM)模式进行正负离子同步检测;监测离子对分别为:没食子酸,m/z(-)168.9→125.0;氧化芍药苷,m/z(-)495.3→136.9;芍药内酯苷,m/z(+)481.3→105.0;芍药苷,m/z(-)525.2→121.0;野黄芩苷,m/z(+)463.1→287.1;灯盏甲素,m/z(+)447.2→271.1;苯甲酰芍药苷,m/z(-)583.3→120.9。3对照品溶液的制备精密称取氧化芍药苷对照品6.17mg、灯盏甲素对照品2.08mg、苯甲酰芍药苷对照品10.04mg,置50mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得混合对照品溶液A;精密称取没食子酸对照品6.37mg、芍药内酯苷对照品5.06mg、芍药苷对照品15.63mg、野黄芩苷对照品10.42mg,置100mL量瓶中,精密加入混合对照品溶液A10mL置量瓶,加甲醇稀释至刻度,即得混合对照品溶液B。4供试品溶液制备取本品内容物0.1g,精密称定,置100mL量瓶中,加水使溶解并稀释至刻度,摇匀,精密吸取该液5mL,置50mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,用0.22μm微孔滤膜滤过,取续滤液作供试品溶液。5测定化合物与对照品溶液的保留时间精密吸取混合对照品溶液B、供试品溶液各1μL,分别进样,结果见图1。供试品溶液中被测定化合物与7个对照品的保留时间相同。比较被测定成分和对照品的母离子、子离子质谱图,两者一致,表明本法专属性良好。6仪器精密度与重复性6.1线性关系考察精密量取混合对照品溶液B1,2,4,6,8,10mL分别置于6个25mL量瓶中,加甲醇定容至刻度,摇匀,制得6个系列浓度线性工作液,分别进样测定。以色谱峰峰面积(A)为纵坐标,以对照品浓度(C)为横坐标进行线性回归,得各被测成分的回归方程、相关系数、线性范围及定量限(LOQ)和检测限(LOD),见表2。6.2精密度取混合对照品溶液重复进样6次,测定峰面积。没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、灯盏甲素和苯甲酰芍药苷峰面积的RSD(n=6)为2.69%,1.79%,3.07%,2.85%,3.71%,2.13%,3.93%。结果表明,仪器精密度良好。6.3重复性精密称取同一批注射用辛芍(冻干粉针)(批号:20100612),共6份,按“供试品溶液”项下方法操作,在上述色谱条件下进样,没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、灯盏甲素和苯甲酰芍药苷的平均含量(n=6)分别为9.27%,1.22%,7.32%,23.71%,16.39%,0.39%,3.66%;RSD(n=6)分别为3.23%,2.14%,3.82%,1.73%,3.01%,2.59%,1.35%。结果表明,重复性良好。6.4稳定性取同一批注射用辛芍(冻干粉针)样品(批号:20100612),分别在0,1,2,4,8,12h进样分析,测得没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、野黄芩苷、灯盏甲素和苯甲酰芍药苷峰面积的RSD(n=6)分别为2.43%,3.66%,2.59%,3.87%,3.03%,4.17%,3.23%。结果表明,供试品溶液在12h内稳定性良好。7注射用辛嫌犯冻干粉针的理化性质测定随着色谱技术的发展和仪器性能的提高,多成分含量测定方法已成为中药现代化质量控制的重要手段和趋势［7－8］,与现行的单一指标成分定性、定量检测的中药质量评价方法相比,可有效地量化检测中药各化学成分的综合信息,突出了中药整体性的特点,更为科学合理。本研究采用UPLC-MS/MS建立了注射用辛芍(冻干粉针)多指标成分含量测定方法,在4min内同时测定了制剂中7个含量相对较高的指标成分,简便、快速、准确,并实现了对药物成分整体把握,可较为全面地控制注射用辛芍(冻干粉针)质量。为加强中药、天然药物注射剂的质量管理,促进中药、天然药物研制工作进一步规范化、科学化和标准化,2008年12月国家食品药品监督管理局正式出台了《中药、天然药物注射剂基本技术要求》,规定注射剂中所含成分应基本清楚,多成分制成的注射剂,总固体中结构明确成分的含量应不少于60%。本研究对3个批次的注射用辛芍(冻干粉针)中试样品进行了测定,其可测成分含量在61.24%~63.47%之间,基本符合《中药、天然药物注射剂基本技术要求》,为注射用辛芍(冻干粉针的研究开发提供了科学依据。加样回收率及rsd6.5回收率精密称取6份已知含量的注射用辛芍(冻干粉针)样品(批号:20100612)约0.05g,分别精密加入0.563mg·mL-1没食子酸、0.084mg·mL-1氧化芍药苷、0.437mg·mL-1芍药内酯苷、1.437mg·mL-1芍药苷、1.003mg·m