淫羊藿苷对去卵巢大鼠骨和下丘脑不同核团ermrna表达的影响

淫羊藿苷对去卵巢大鼠骨和下丘脑不同核团ermrna表达的影响

骨质疏松症（op）是一种以骨量少和骨微观结构退化为特征的特征，导致骨脆弱和全身骨的代谢疾病。雌激素缺乏导致骨吸收亢进,是绝经后骨质疏松(postmenopausalosteoporosis,POP)的主要病因,以往多采用雌激素替代疗法(estrogenreplacementtherapy,ERT),但是,近年来研究显示ERT有增加乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌的风险,因此,从植物来源的选择性雌激素受体调节剂(selectiveestrogenreceptormodulator,SERM),即植物雌激素逐渐引起学者的兴趣。前期研究表明,由淫羊藿组成的补肾复方在抑制骨量丢失,改善骨密度方面有明显疗效;体外实验也证实淫羊藿总黄酮可以促进成骨细胞增殖与分化、抑制破骨细胞的分化和吸收功能。众多学者对于淫羊藿抗骨质疏松作用的研究以总黄酮及总提物为主,2010年《中国药典》指定淫羊藿苷(Icariin,ICA)为淫羊藿(Epimediifolium)的质量鉴定指标,目前ICA对骨和下丘脑ERβmRNA表达量的影响国内外研究较少。深入研究ICA对去卵巢所致的骨质疏松大鼠骨和下丘脑不同核团ERβmRNA的调节,对于研究淫羊藿抗骨质疏松作用机制具有非常重要意义。1材料和方法1.1材料表面1.1.1实验动物健康10～11月龄SD♀大鼠60只,体质量(400±50)g,由河北医科大学实验动物中心提供。1.1.2乙醇-水梯度洗脱小檗科植物淫羊藿(EpimediumbrevicornuMaxim)干燥地上部分45kg,用10倍量水回流提取2次,每次2h,经大孔吸附树脂柱色谱分离,体积分数为0%、30%、50%、95%乙醇-水梯度洗脱。取50%乙醇洗脱部分浸膏1.2kg,用硅胶柱色谱分离,氯仿-甲醇梯度洗脱,得到16个流份。第10个流份析出沉淀13.5g,经SephadexLH-20柱色谱纯化、HPLC制备后得一单体化合物(纯度>99%),通过NMR、IR等波谱学方法鉴定产物为淫羊藿苷(C33H40O15),其结构见Fig1。1.1.3pcr检测产物仪器:OLYMPUS显微镜(日本),PCR扩增仪(GeneAmpPCRSystem2400,美国),美国MIS-2000SP型3Y显微图像分析仪,3Y分析软件(Pro,Ver,4.0)。试剂:17β-雌二醇(17β-E2,Sigma),RT反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTP和TRIzol总RNA提取试剂盒均为MBI公司产品。琼脂糖为上海博亚生物工程公司产品,ERβmRNA原位杂交试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)。PCR引物由上海博亚生物工程公司合成,ERβ引物序列:上游5′-TCACCGTCGAGCCTTAGTTC-3′,下游5′-TCTGCATAGAGGAGCGATGA-3′,扩增片段长度为286bp。内参GAPDH引物序列:上游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,下游5′-TCCACCACCCTGCTGTA-3′,扩增片段长度为450bp。1.2方法1.2.1组织病理学检测大鼠按清洁级标准,适应性喂养1周后,用本实验室建立的背驮式切除双侧卵巢方法造成骨质疏松动物模型:腹腔注射1%戊巴比妥钠(40mg·kg-1BW)麻醉后,切除双侧卵巢,余12只做相同的手术操作,背部切口,找到卵巢后,只切除少量脂肪组织后缝合,但不切除卵巢,作为假手术组(Sham)。将切除卵巢的大鼠随机分为4组:去卵巢模型组,淫羊藿苷治疗小、中、大剂量组:分别给予25、50、100mg·kg-1ICA混悬液。模型组和Sham组:灌胃给予等体积蒸馏水,每周测体重1次,每组12只,切除双侧卵巢术后1周,开始给药,持续给药4个月,颈动脉取血处死动物,分离血清,取椎骨、胫骨、下丘脑、子宫(称湿重)等标本检测。1.2.2样品的收集和检测1.2.2.1.血清激素测试采用放射免疫法(RIA法)检测雌二醇(E2),放免分析试剂盒由中国医学科学院核医学技术中心提供,操作步骤按说明书进行。1.2.2.骨密度的测定取椎骨(L3),剔除肌肉及筋膜,生理盐水冲洗,用美国Lunar公司双能X线骨密度仪及其所附的“TheSmallSubjectScan”小动物测定软件测量。1.2.2.灌流液及多聚甲醛磷酸盐缓冲液注意事项用10%水合氯醛麻醉动物(3ml·kg-1BW),腹面朝上,四肢固定在木板上,剪开胸腔,将右心房及左心室尖剪开,用乳胶管从左心室尖插入心室并从左房室孔进入主动脉,将0.9%生理盐水从乳胶管滴入体循环,血液从右心房流出5～10min后,右心房流出的液体基本无色(0.1L0.9%生理盐水)时,将灌流液换为4.0%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(PBS)固定液,这时动物会抽搐(表明灌注效果良好),继续灌注20～30min,取出下丘脑不同核团组织于预先备好的EP管中,封口,立即放入液氮罐中,后放入超低温冰箱保存。1.2.2.dntps-pcr反应①组织总RNA提取:用变性液将胫骨骨骺均质化后,用TRIzol试剂一步法提取下丘脑不同核团组织和胫骨总RNA。②反转录(reversetranscription,RT):总反应体积为40μl,提取的RNA2μg,引物(OligodT)2μl,充分混匀,70℃5min;再加入5×反应缓冲液8L,4μldNTPs,RNase抑制剂0.5μl,DEPC水定容至39μl,充分混匀,37℃5min;再加入MMLV反转录酶1μl,充分混匀,42℃孵化60min;70℃加热10min停止反应。③PCR扩增:PCR总反应体积为20μl,其中包括:10×PCRbuffer2μl,MgCl22μl,dNTP0.2μl,ERβ上游引物和下游引物各1μl,ddH2O11.6μl;RT反应物2μl;TaqDNA多聚酶0.2μl,离心1min,进入PCR循环。扩增条件:95℃3min;32个循环(94℃1min,59.4℃1min,72℃1min);72℃7min。④电泳:1.5%琼脂糖凝胶,电压100V。⑤检测:应用Smartview生物电泳图像分析系统进行吸光度扫描,分析ERβ和内参GAPDHmRNA表达,二者吸光度比值作为所测样品中ERβmRNA相对表达量。1.3统计分析数据用x¯±sx¯±s表示,应用SPSS11.0软件进行统计学处理,组间比较采用方差分析。2各组大鼠血清中ermrna表达比较与假手术(Sham)组相比,模型组大鼠BMD、E2、子宫湿重和子宫/体重比值明显下降(P<0.01)。与模型组相比,淫羊藿苷50.0和与100.0mg·kg-1组大鼠BMD、E2明显升高(P<0.01),子宫湿重和子宫/体重比值差异无显著性(P>0.05)。见Tab1。与假手术组相比,模型组大鼠胫骨和下丘脑弓状核ERβmRNA表达明显降低(P<0.01),下丘脑室旁核、视上核ERβmRNA表达均明显升高(P<0.01)。与模型组相比,淫羊藿苷50.0和100.0mg·kg-1组治疗后,胫骨和下丘脑弓状核ERβmRNA表达明显升高(P<0.01),下丘脑室旁核、视上核ERβmRNA表达均明显降低(P<0.01),子宫湿重无改变(P>0.05)。见Tab2。3药代动力学—讨论绝经后妇女体内雌激素水平下降,骨量丢失增加,导致绝经后骨质疏松(postmenopausalosteoporosis,POP)已成为老龄化社会问题,卵巢切除SD大鼠是一个成熟的绝经后骨质疏松动物模型。本实验大鼠卵巢切除后,血清雌激素水平明显降低,说明卵巢切除完全;椎骨骨密度明显降低,表明模型成功。淫羊藿苷使卵巢切除大鼠骨量丢失减少,可以提高去卵巢大鼠的椎骨骨密度,对子宫没有不良反应。一般认为,卵巢功能衰退是引起POP的始动因素,但随着研究的深入,发现生殖衰老过程有多个启动点,下丘脑等上位腺体功能改变先于卵巢功能的衰退,中枢神经系统(centralnervoussystem,CNS)改变是造成POP的重要因素,CNS中存在雌激素受体(estrogenreceptor,ER),CNS是雌激素(estrogen,E)的靶器官,下丘脑是ER重要靶器官,ER在下丘脑主要分布于视上核、室旁核、视前区和腹内侧核等核团。ER与雌激素结合后,直接与DNA上的ER反应元件结合,调节雌激素应答转录因子的活动,ERs存在两种亚型:ERα和ERβ,二者区别在于其C末端配体结合区和N末端活性转化区不同,从而在靶组织中分布也不同。下丘脑室旁核(paraventricularnucleus,PVN)紧贴第三脑室,呈长条形,背侧达下丘脑沟,头腹端在视交叉上方,PVN是一个重要的神经内分泌核团,ERs在PVN的表达具有动物种属差异性:在大鼠PVN,ERβ是唯一的雌激素受体,介导雌激素对大鼠PVN神经结构与神经内分泌活动的调节;在小鼠PVN内还有ERα表达,但相对于ERβ来说,ERα的表达很低。类固醇激素可下调小鼠PVN内ERβ的表达。“肾主骨”的理论是“肾-骨-髓-血-脑”一体,肾为先天之本,主藏精,精生髓,髓居于骨中,骨赖髓以充养,脊髓上通于脑,脑为髓之海。肾藏五脏六腑之精,灌输、濡养、滋润靶器官-骨、脑。女子七七(49岁)肾气衰,骨髓生化乏源,髓海不足,骨骼失养,易发骨质疏松症,治疗骨质疏松症,多用补肾法。淫羊藿辛、甘,温,归肝、肾经,《本草备要》记载“补命门,益精气,强筋骨”,用于肾阳虚衰,筋骨痿软,阳痿遗精,风湿痹痛,麻木拘挛。淫羊藿对POP动物模型有对抗作用,其所含植物雌激素淫羊藿苷是主要有效部位,体外实验证实植物源性雌激素与ERβ的亲和力较高,而动物源性雌激素与ERα有较高亲和力。以往有关植物源性雌激素对下丘脑不同核团ER调节作用的报道很少,本实验结果显示,大鼠卵巢切除后,胫骨和下丘脑弓状核ERβmRNA表达明显降低,下丘脑室旁核、视上核ERβmRNA表达均明显升高。与去卵巢模型组比较,淫羊藿苷50.0和100.0mg·kg-1组治疗后,胫骨和下丘脑弓状核ERβmRNA表达明显升高,下丘脑室旁核、视