电针内关穴抗心肌缺血作用的实验研究

电针内关穴抗心肌缺血作用的实验研究

内关穴是治疗心血管疾病的重要穴之一。大量的临床和实验研究证明,针刺内关具有显著的抗心肌缺血损伤作用,且该作用具有明显的相关特异性。下丘脑室旁核(paraventricularnucleus,PVN)是下丘脑前区最重要的核团之一,既参与自主神经调节,又参与神经内分泌控制,与下丘脑、脑干、脊髓等中枢自主神经核团间存在广泛的纤维联系,是心血管系统活动调节的重要核团。研究显示,PVN内存在丰富的内阿片肽能神经元、神经末梢及阿片受体,对心血管功能发挥重要的紧张性抑制作用。本实验在前期研究证明电针“内关”对急性心肌缺血有保护作用的基础上,进一步观察PVN内微量注射阿片受体拮抗剂纳络酮对电针“内关”穴抗心肌缺血损伤作用的影响,探讨电针“内关”抗心肌缺血损伤的作用机制。1材料和方法1.1实验家兔1.2清洁级日本大耳白兔40只(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,批号:19-025),在湖北中医学院实验动物中心饲养,室温25℃。体重1.8~2.3kg,雌雄不限。将实验家兔按随机数字表法分为模型对照组(10只):PVN人工脑脊液注射60min后行心肌缺血造模,不治疗;纳络酮对照组(10只):PVN纳络酮微量注射60min后行心肌缺血造模,不治疗;电针加脑脊液组(10只):PVN人工脑脊液注射60min后行心肌缺血造模,随即电针“内关”穴;电针加纳络酮组(10只):PVN纳络酮微量注射60min后行心肌缺血造模,随即电针“内关”穴。各组动物处理按照下述实验方法进行。1.2实验方法(1)pvn微量注射实验家兔用20%乌拉坦(800mg/kg)行耳缘静脉注射麻醉后,俯卧固定在脑立体定位仪上(WDT-Ⅱ型,国营西北光学仪器厂生产),颅顶备皮,剪开皮肤,用3%双氧水涂擦,暴露颅骨,确定前囟中点、人字缝,使人字缝尖端低于前囟1.5mm。按Sawyer氏兔脑图谱,以前囟中点为坐标零点时PVN坐标为AP:0mm,L(R):±0.5mm,H:-13.5mm,前囟不规则兔按金观源等方法进行坐标修正,定位PVN。用牙科电钻行颅骨开孔,将微量注射器固定在脑立体定位仪的专用电极操纵控制器上,按上述坐标以先左后右顺序分别进行两侧PVN微量注射。每侧PVN注射纳络酮1μL(人工脑脊液稀释,2μg/μL)或人工脑脊液1μL(注射用时2min,留针10min)。注射结束后骨蜡封口。(2)相互分离左心PVN内微量注射结束后60min进行急性心肌缺血造模。将实验家兔仰卧固定于兔台上,胸前壁备皮并铺消毒孔巾,从胸骨柄稍下方至胸骨剑突上方约2cm处,做正中皮肤切口,沿胸骨左缘分离胸壁肌肉,并剪断左侧第3、4肋软骨(注意紧贴胸骨左缘开胸,以免伤及左侧内乳动脉和造成气胸)。然后用开胸器暴露心脏,剪开心包,暴露左心耳及大部分左心室,再在左心耳下缘仔细寻找冠状动脉前降支,并于左室壁上、中1/3交界处,以细圆针引丝线结扎,阻断冠状动脉血流。模型成功的标志:收紧结扎线后,左室前壁发绀向外膨胀及Ⅱ导联心电图S-T段抬高、T波高耸。(3)电针治疗内关在结扎冠状动脉左前降支(leftanteriordescending,LAD)后,立即记录心电图及左心室心肌细胞跨膜电位,记录完毕后,对电针加脑脊液组、电针加纳络酮组进行电针治疗。按照中国针灸学会实验针灸研究会1992年制订的《实验动物穴位定位标准》,取“内关”穴(前臂下1/6折点处外侧,桡、尺骨缝中)。用G6805-Ⅱ型电针治疗仪对双侧“内关”穴进行电针刺激,通电30min,电针参数:选用连续波、振幅1.2V、频率7Hz、强度0.6mA。(4)心电记录及主被动在PVN注射前后、心肌缺血造模前后不同时间段分别进行心电图记录。动物麻醉后静置15min,记录心电图(Ⅱ导联)作为基础对照。随后于PVN注射完毕即刻,注射后15min、30min、45min、60min,冠状动脉前降支结扎即刻(电针“内关”穴前),电针后15min、30min、45min、60min各时间点记录Ⅱ导联心电图1次。每次记录1min,心电记录纸速25mm/s,波幅1mV。测量10个心动周期的ST段电位,计算其平均值。(5)材料制备和测量记录时间:分别在冠脉结扎前(暴露心脏后),冠脉结扎后即刻(心电图记录后,电针“内关”穴前),电针后15min、30min、45min、60min记录左心室肌细胞跨膜电位,每次记录5min。记录方法:采用全自动拉制仪(P-83电极拉制器,Narishige,日本)进行玻璃微电极拉制。显微镜下检查电极形状及尖端开口,尖端外径应小于0.5μm。实验前充灌入3mol/LKCl溶液,测电阻在10~30MΩ之间为理想玻璃微电极。实验时,将自制悬浮螺旋状银丝固定于微电极操纵器上,尾端与微电极放大器(JL-H2003,上海嘉龙教学仪器厂)输入端相连,银丝头端插入玻璃微电极尾端的溶液中(玻璃微电极固定在银丝头端)。测量时,暴露心脏,调节微电极操纵器,将微电极尖端插入左心室肌心尖部(结扎点下4~5mm,前室间沟左侧2~3mm),引导左心室前壁单个心室肌细胞跨膜电位,引导信号经微电极放大器输入到四道生理记录仪(RM-6200型,成都仪器厂生产)。分析:静息电位(RP)、动作电位振幅(actionpotentialamplitude,APA)、动作电位复极50%、90%时所需时间(actionpotentialdurations,APD50、APD90)。分析动作电位按下列标准选择:①基线平稳;②造模前记录中APA不小于100mV,RP绝对值不小于70mV;③可稳定记录动作电位5min以上;④除动作电位上升支起始部偶有伪迹外,其他部位无任何伪迹;⑤取连续10个动作电位的均值计算各参数。(6)心肌细胞超微结构变化心电图及心肌细胞跨膜电位记录结束后,家兔断头处死。取左心室前壁距心尖部0.5~1cm处心肌组织,2.5%戊二醛锇酸固定液固定,常规EPON812包埋,超薄切片,醋酸铀-枸缘酸铅染色,透射电镜观察心肌细胞超微结构变化。取脑,10%甲醛固定,常规石蜡包埋切片,HE染色,组织学观察PVN注射点情况。(7)单因素方差分析实验数据以—x±s表示,采用SPSS10.0软件包进行单因素方差分析(one-wayANOVA),方差齐者组间比较用SNK(Student-Newman-Keuls)检验,方差不齐者用Games-Howell检验。2结果2.1pvn注射成功情况用于PVN微量注射家兔共53只。其中28只注射人工脑脊液,25只注射纳络酮。各有20只(共计40只)注射点位于双侧PVN内,视为PVN注射成功(见图1)。实验数据纳入统计学处理。另有13只家兔或仅单侧PVN内存在注射点,或双侧注射点偏差较大,视为PVN注射失败,实验数据不纳入统计学处理。注射点中心位于PVN内的40只家兔(共计80个注射点),其注射点位于内侧小细胞部者有32个,位于外侧大细胞部者有28个,位置偏浅位于背侧小帽下方有5个,另有15个注射点位置稍深,介于内侧小细胞部和外侧大细胞部之间的下部。2.2对pvn注射点超微结构的影响电镜下观察,各组心肌细胞均呈现不同程度的1.PVN外侧大细胞部;2.PVN内侧小细胞部;3.PVN腹侧部;4.PVN背侧小帽;5.视束;6.视上联合;7.下丘脑外侧区;8.未定带;9.连结核;10.示一侧PVN注射点分布范围缺血性改变,主要表现为:心肌细胞肿胀,肌原纤维排列紊乱,肌原纤维断裂并可见闰盘处变性;线粒体明显肿胀,峭断裂;血管内皮细胞肿胀严重,吞饮小泡明显减少,电子密度不均匀,部分内皮细胞核与胞体分离等。模型对照组和纳络酮对照组心肌细胞超微结构变化较为典型,差异不明显;电针加脑脊液组缺血区心肌细胞肿胀较轻,肌原纤维排列整齐,肌丝清晰,基本无断裂,线粒体肿胀较轻,未见线粒体峭断裂情况,血管内皮细胞轻度肿胀,吞饮小泡丰富;电针加纳络酮组损伤情况介于电针加脑脊液组与模型对照组、纳络酮对照组之间。2.3纳络酮微量注射对正常家兔心肌功能的影响各时间段各组家兔Ⅱ导联心电图ST段电位变化见表1。表1示PVN微量注射前后(心肌缺血造模前)各组ST电位组间及组内比较差异无显著性意义(P>0.05);冠脉结扎后各组各时间段ST段电位较结扎前显著升高,其中以电针后15min变化最为显著;冠脉结扎后即刻4组间差异无显著性意义(P>0.05);电针后15min、30min及45min3个时间段纳络酮对照组与模型对照组比较差异无显著性意义(P>0.05),电针后60min纳络酮对照组ST段电位值较模型对照组低(P<0.05);电针后15~60min4个时间段电针加脑脊液组和电针加纳络酮组ST段电位值均显著低于模型对照组和纳络酮对照组(P<0.05),且电针加脑脊液组显著低于电针加纳络酮组(P<0.05)。以上结果提示PVN纳络酮微量注射对正常家兔心肌功能无影响,对缺血心肌功能影响轻微,在结扎(缺血)60min时发挥一定的保护作用;电针“内关”穴对缺血心肌有明显的保护作用,该作用可被PVN注射纳络酮所削弱,但不能完全阻断。2.4paa、apd各时间段各组心肌细胞APA、APD50、APD90变化见表2~表4。各组冠状动脉结扎电针后与结扎前比较,APA、APD50、APD90值均发生显著变化(P<0.05);与模型对照组比较,纳络酮对照组各时间段APA、APD值大多升高,其中电针后60min纳络酮对照组APA值显著高于模型对照组(P<0.05);电针加脑脊液组与其他各组比较,电针后15~60min4个时间段APA、APD值均显著高于其他各组(P<0.05);各时间段,电针加纳络酮组与模型对照组、纳络酮对照组比较无显著差异(P>0.05),与电针加脑脊液组比较,在电针后各时间段有显著差异(P<0.05)。以上结果提示缺血对心肌细胞APA、APD50、APD90存在显著影响;PVN纳络酮注射对缺血心肌细胞跨膜电位及复极时间具有一定影响;电针“内关”穴对缺血心肌具有明显保护作用,该作用可被PVN纳络酮微量注射明显削弱。3pvn及其内阿片肽对电针“内关”穴抗心肌缺血效应的作用纳络酮(Naloxone,NLX)为17-烯丙基-4,5a-环氧基-3,14-二羟基吗啡喃-6-酮,是特异性的阿片受体拮抗剂,对三种阿片受体亚型μ、κ、δ均有拮抗作用。多年来作为工具药而广泛应用,近年也有一些用于针刺信息的中枢通路及针刺效应中枢机制的研究,但尚未见应用于探讨PVN内阿片肽在电针“内关”穴抗心肌缺血损伤中的作用的研究报道。PVN位于第三脑室下丘脑部的上端两侧,呈长楔形轮廓,是下丘脑前区最显著的核团之一,在心血管系统活动及神经内分泌调节等方面发挥重要作用。PVN存在有大量肽能神经纤维、肽能神经元及丰富的阿片受体(μ、κ、δ亚型),与下丘脑、脑干、脊髓等中枢自主神经核团间存在广泛的纤维联系。一般认为,中枢内源性阿片肽系统是一个潜在的心血管调节系统,内阿片肽在PVN中起着重要的紧张性抑制作用。本实验发现,电针“内关”穴对心肌缺血具有明显的保护作用,该作用可被PVN微量注射纳络酮所削弱但不能完全阻断