针刺对下丘脑室旁核胃相关神经元作用的影响

针刺对下丘脑室旁核胃相关神经元作用的影响

穴位选取的原则1.使用细胞外记录技术在大鼠胃扩张的基础上发现特定的室侧核胃函数，并观察不同针刺方法对下肢室侧核胃函数的影响。2文中选“足三里”、“内关”、“脾俞”、“胃俞”4个穴位是近年针灸治疗胃肠道疾病中应用频率最高且有效的主穴,选穴具有科学性。3实验重点观察了高位中枢如室旁核在针刺治疗胃肠道疾病中所发挥的作用,为经脉-脏腑相关理论及临床指导提供依据。0室旁核与内脏功能系统下丘脑利用其整合功能对自主神经进行调节,通过将不同内脏功能及躯体运动、内分泌、情绪等整合以达到维持内环境稳定的目的。下丘脑室旁核位于下丘脑的上端,第三脑室的两侧,其作为下丘脑前区最重要的核团之一,在对内脏活动的整合和内分泌系统的调控中发挥了不可替代的作用。同时,室旁核(hypothalamicparaventricularnucleus,PVN)接受来自上行的内脏和躯体感觉系统的传入,凭借着其与脑内边缘系统、孤束核、迷走神经背核之间广泛的纤维投射,参与了对内脏功能活动的调控。课题组前期的研究显示,来自心胃等内脏的初级传入信息和体表的针刺感觉信息,在孤束核(nucleusofthesolitarytract,NTS)进行信息的汇聚及整合后,可能向高位中枢传递。有研究表明孤束核与室旁核之间存在着双向纤维投射,既往关于针刺对胃功能的调节作用机制多以外周为主,涉及中枢尤其是高位中枢的研究较少,因此本研究旨在通过观察胃的内脏感觉传入和针刺穴位的躯体感觉传入在室旁核的整合作用,探讨室旁核对针刺调节胃运动作用机制的影响,为进一步发展经(脉)穴-脏腑相关理论提供更为丰富的理论依据。1胃扩张刺激试验设计:动物实验观察。时间及地点:实验于2013年3至9月在广东省肇庆市康达动物实验中心实验室完成。材料:实验方法:体表刺激点定位:按照中国针灸学会实验针灸研究会1992年制订的《实验动物穴位定位标准》及拟人对照法。内关:前肢下1/6折点处内侧,桡、尺骨缝中;足三里:腓骨小头下约5mm;脾俞:第11、第12胸椎棘突间旁开5mm处;胃俞:第12胸椎棘突下旁开5mm。胃扩张造模:大鼠于实验前禁食不禁水24h,予以20%乌拉坦(6mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠,上腹部剔除毛发,于剑突下沿腹白线纵向剪开皮肤、肌层和腹膜,充分暴露胃体,用小剪刀在距离幽门0.5cm处的十二指肠处避开血管,剪一个“一”字形小口,将连接在聚乙烯软管上的气囊推进胃内,推至胃窦部后,将切口荷包缝合,接注射器针头的聚乙烯软管经三通管与压力换能器及充满蒸馏水的注射器连接,完全排空气囊、软管等处的气泡后,校对换能器,向气囊内注水5-8mL,记录胃内压≥5.32kPa(40mmHg)时所需的注水量。针刺时,每扩张90s需抽回气囊内的水,停止胃扩张刺激60s,以维持胃扩张的压力,防止长时间的扩张损伤胃。室旁核放电记录:大鼠行胃扩张造模后,将其固定于脑立体定位仪上,参照Paxions-Watsona大鼠脑立体定位图谱对室旁核进行精准定位(AP:1.5mm,L:0.4mm,H:6.8-8.2mm)并钻孔。于显微镜下缓慢地将电极插推至脑表面,予石蜡油覆于脑表面以防止干燥及减少脑波动对电极位置的影响。在微电极推进器的操作下,以1µm/s的速度将金属电极推进至室旁核,遇到放电即刻停止,待放电基线平稳后,予以胃扩张刺激30s,同时记录胃内压;放电平稳后再分别针刺“足三里”、“内关”、“脾俞”、“胃俞”等穴位各30s。电极部位的确定:灌流取材:每只大鼠记录完毕后,室旁核予以电损毁,损毁参数为连续单电流,强度为1mA,频率50Hz,波宽0.5ms,持续1min。开胸,经左心室插管至升主动脉,先用150mL生理盐水冲去血液,再以体积分数为10%甲醛溶液灌注固定,持续时间40-45min。取下丘脑,于上述新鲜固定液中固定。1周后行冰冻冠状连续切片,切片厚度为30µm,贴于载玻片上,光学显微镜下进行标记位点鉴定。取记录位点及损毁位点(如图1所示,红色三角形区域为核团的位点,为室旁核)正确的单位进行统计分析,位置不符合者资料弃之不用。主要观察指标:神经元放电数。资料分析:采用Spike2神经信号分析软件(UK)进行数据的分析处理。神经元对刺激的反应主要有兴奋、抑制和无反应有3种情形,以刺激前后神经元放电频率变化超过30%作为标准。刺激前后频率变化增加30%为兴奋性神经元,刺激前后频率变化减少30%为抑制性神经元,刺激前后频率变化在30%内为无反应神经元。实验结束后进行组织学鉴别,电极记录部位不正确者,数据弃之不用。2室旁核胃扩张神经元对针刺的反应率2.156个室旁核胃扩张相关神经元对针刺腧穴的反应60只大鼠共记录到109个室旁核神经元放电。109个室旁核神经元中与胃扩张相关的神经元有56个,56个胃扩张相关神经元对体表刺激反应的反应结果如表1所示。2.2室旁核胃扩张神经元对针刺有反应神经元的出现率60只大鼠的4个穴位有反应神经元的出现频率各有差异,其反应均以兴奋性为主,其出现率如表2所示。在109个自发放电的神经元中,56个胃扩张相关神经元中兴奋性神经元占40个,而抑制性神经元仅占16个,且40个胃扩张兴奋性神经元中对来自体表的刺激也以兴奋性神经元为主。56个胃扩张相关神经元中,对针刺足三里(图2A)、内关(图2B)、脾俞(图2C)、胃俞(图2D)有反应的神经元个数分别是43,47,28,35,有反应的神经元出现的比例分别是76.79%,83.47%,50.00%,62.50%。3穴位与内脏功能经脉-脏腑相关理论是近年来针灸临床和机制研究的核心问题,经脉和脏腑间的复杂联系成为中医理论体系中的亮点。《灵枢·海论》篇强调:“夫十二经脉者,内属于府脏,外络于支节。”肢,是指四肢,节,是指骨节,亦指穴位,说明经脉在其循行过程中分别归属于相应的脏或腑,同时与相表里的脏腑发生属络关系。亦提示十二经脉的重要功能是沟通脏腑与体表肢节之间的联系,有学者称之为“是世界上最早提出躯体内脏相关的学说”。《素问·调经论》云“五脏之道皆出于经隧,以行其血气,血气不和,百病乃变化而成”,意在说明气血通过经络的运行来达到濡养内脏的功能,不能濡养内脏,则百病皆生,切实说明了气血通过经络对五脏的濡养之功。《灵枢·经脉篇》和《素问·骨空论》有这样的阐述,足阳明胃经(起于鼻……从大迎前下人迎,循喉咙,入缺盆,下膈,属胃……),其循行联系的脏腑和五官有胃、脾、心、小肠及鼻等。手太阴心经(……其支者,复从心系却上肺……),其联系的脏腑及五官包括心、小肠、肺及咽等。足太阴脾经)……上膝股内前廉,入腹,属脾,络胃……),其联系的脏腑及五官有脾、胃、心及舌等。由此可见,一脏可与多条经脉联系,相应的脏腑除了与互为表里的经脉联系外,还和其他的经脉有直接或间接的关联,这就构成了广泛的经脉-脏腑相关系统。《素问·经脉别论》曰:“食气入胃,浊气归心,淫精于脉,脉气流经,经气归于肺,肺朝百脉,输精于皮毛,毛脉合精,行气于府,府精神明,流于四脏,气归于权衡,权衡以平,气口成寸,以决死生。”说明水谷精微在濡养经脉的同时亦通过经脉之气,输注于脏腑,这也间接地阐述了经脉与脏腑之间的联系。中医学认为“有诸内,必形诸外”,即人体是一个内外紧密联系的整体,内脏有病,可反应于相应的形体官窍。而人为地刺激体表某些相应的穴位,也能引起相关内脏功能的改变,进而起到治疗作用。经络是经脉和络脉的总称,有着运行气血、沟通人体上下和联络脏腑肢节的功用,有学者认为揭示体表与体表、体表与内脏之间的特定联系是经络学说的精华所在。《素问·调经论》:“五脏之道皆出于经隧,以行其血气,血气不和,百病乃变化而成”高度概括了经脉和五脏之间的联系。《灵枢·海论》:“夫十二经脉者,内属于府藏(腑脏),外络于支节”则强调了十二经脉在沟通脏腑和体表联系中发挥的重要作用。解剖学和神经生物学研究认为,针刺信息主要通过刺激感受器外周神经系统,将神经冲动上传至中枢神经系统,通过中枢神经系统进行信息整合来调控神经、内分泌、体液网络,继而影响靶器官。以往的研究表明,这种经络现象是脊髓水平神经活动的一种功能表现,它按相对特异的传入-传出-传入反射活动的模式来监视机体的功能状态。从神经解剖学的躯体传入来看,内关和足三里分别是手厥阴心包经和足阳明胃经的穴位,两者均与胃有密切关系,且两者分别处于不同的神经节段。根据神经生物学的理论原则,穴位以节段性、节段间及脊髓上的作用为基础来对内脏功能活动进行调节。以往研究显示“足三里”穴区的传入冲动主要通过躯体神经和血管壁神经丛两条途径上行,投射到T6-S3脊神经节,“内关”穴传入神经元主要位于C6-T1,而支配胃的神经节段位于T5-T9,由此可见胃与足三里穴区的传入神经元在下胸部及腰部是相互交汇及重叠的部分,而内关穴的传入神经元与胃的传入神经元不在同一神经节段。这就明确的阐述了穴位对内脏功能的整体性、超节段性调节作用与整个中枢神经系统的功能完整性有关,尤其与脊髓上的各级中枢的作用密切相关。脾俞和胃俞均属于背俞穴,临床常选用于治疗消化道疾病,与胃有着高度的相关性,对于胃机能活动有着双向调节作用。其神经支配节段分别位于T7-T11和T8-T12,本实验结果显示针刺脾俞及胃俞反应性低于内关及足三里,首先从解剖位置的观点来看,足三里和内关凭借着其与胃传入神经节段的多处交汇及重叠而对体表刺激产生强烈反应,脾俞及胃俞仅与胃传入神经节段有少量重叠,因此作者大胆猜测脾胃俞穴与胃可能存在着中枢以外的传递途径。第二,实验中观察到在针刺穴位记录神经元放电的过程中,针刺脾俞和胃俞所产生的神经元放电单位都有数秒乃至十秒的反应潜伏期,在30s左右达到放电的高峰。作者大胆地将这一反应归类于穴位的继发信息,即穴位在受到刺激后,激活局部的组织、血管和神经等产生化学物质,继而引起中枢核团的反应。继发信息的特点即为产生反应的时间慢,而持续的时间长。下丘脑作为自主神经系统中的高级中枢,在协调自主和感觉信息方面发挥着举足轻重的作用,而室旁核不仅在下丘脑中占据了重要的解剖位置,也在下丘脑调节内脏活动和内分泌活动的功能中扮演了重要的角色。针刺信息作为一个有传入性功能影响的效应,在初级神经中枢接收到来自体表的针刺信息后,可向更高级的中枢核团室旁核传递,此类信息到达室旁核后,激活了其内分泌活动等状态,从而对体表信息进行整合处理。大量的实验研究表明,室旁核在调节胃运动中发挥了重要的作用,其对胃酸分泌、胃运动及胃黏膜损伤均有着明显的影响。早在20世纪80年代,Rogers等的研究就已证实,单侧电刺激室旁核可明显增加胃酸的分泌及增强胃的运动性。而Morrow等的研究亦证实,下丘脑室旁核在微量注射促甲状腺激素释放激素后可明显增强胃的收缩活动。张文文采用室旁核注射催产素的方法,观察其对胃缺血再灌注损伤的影响,结果显示室旁核注射一定剂量催产素后对胃黏膜缺血再灌注损伤具有显著的保护作用。李慧采用束缚-浸水应激的造模方法制造大鼠胃肠机能紊乱及应激性胃黏膜损伤模型,采用辣根过氧化物酶逆行追踪的方法发现室旁核在胃机能调控中发挥了重要的作用。张咏梅等采用夹闭大鼠腹腔动脉30min,松开动脉夹让血流复灌1h的胃缺血-再灌注损伤的造模方法,观察下丘脑室旁核进行电和化学刺激后,其对大鼠胃缺血-再灌注损伤的影响及胃缺血-再灌注损伤后下丘脑室旁核内c-fos的表达。结果显示在电和化学刺激室旁核的情况下,胃缺血-再灌注损伤程度减轻,且胃缺血-再灌注损伤使得下丘脑室旁核内c-fos表达增加。Zhang等报道下丘脑室旁核对大鼠应激性胃溃疡有重要的调节作用,实验发现下丘脑室旁核在接受电或化学刺激的情况下均可加重应激性溃疡的程度,而电损毁下丘脑室旁核则可减轻溃疡程度。下丘脑室旁核凭借其丰裕的传入、传出纤维,与脑内边缘系统、孤束核及迷走神经背核等组织保持着密切的往返纤维联系。神经径路追踪技术不断更新肯定了下丘脑室旁核与孤束核和延髓腹外侧核之间的纤维往返关系。张咏梅等的实验研究也证实了损毁大鼠双侧孤束核,可取消电刺激下丘脑室旁核对胃缺血-再灌注损伤的保护作用。陈泽斌等则发现同时损毁家兔室旁核及孤束核可减弱电针内关穴对心肌缺血的保护作用,以此说明室旁核与孤束核之间的密切关系。早在20世纪80年代,即有报道对大鼠及猫进行过实验观察,证实下丘脑室旁核与迷走神经背核之间有直接的纤维投射。程世斌等证明迷走神经背核有纤维投射到下丘脑室旁核,亦有实验研究称若干来自蓝斑、背侧延髓迷走复合体及延髓腹侧的内脏感觉、边缘系统的神经纤维联系终止于下丘脑室旁核小细胞内部,因此延髓迷走复合体与下丘脑室旁核小细胞之间存在着纤维的双向投射,其所形成的环路对下丘脑调节内脏刺激反应起着重要的整合作用。王光明等采用下丘脑室旁核内微量注射药物,胃运动及胃电活动呈剂量依赖性增强,而切除膈下迷走神经则可消除此种效应。有研究证明,胃在受到伤害性刺激后,孤束核和延髓腹外侧核内向下丘脑室旁核投射的神经元中有28.2%为FOS阳性细胞。来自顺行和逆行示踪标记的实验研究证明,下丘脑室旁核和迷走神经背核之间存在单突触的往返纤维联系。亦有研究显示,损毁双侧迷走神经背核后,电刺激下丘脑室旁核,大鼠胃位相性收缩波明显增强,损毁双侧迷走神经背核后,可阻断下丘脑室旁核对胃运动的抑制作用,这些信息准确地透露了经下丘脑室旁核整合处理后的胃伤害性刺激可能通过由孤束核和迷走神经背核组成的迷走复合体投射到胃,进而参与胃功能调控的这一事实。图3为大脑相关核团调控胃运动的通路。本实验的研究结果提示,针刺足三里、内关等穴位的刺激信号经脊髓到达孤束核,经孤束核的初步整合后,上行投射激活下丘脑室旁核,体表的刺激信号到达下丘脑室旁核后,由室旁核-延髓背侧迷走复合体-迷走神经通路进行下行投射,经迷走神经到达靶器官-胃,以神经传导及神经内分泌等方式对胃的功能活动进行调节。由此可推断,下丘脑室旁核中存在着对胃扩张刺激和针刺刺激其反应的躯