超氧化物歧化酶的制备

超氧化物歧化酶（SOD）的制备超氧化物歧化酶，简称SOD（SuperOxideDismutase）,是一种广泛存在于动、植物及微生物中的金属酶，至少可分为三种类型：第一种类型-Cu・Zn-SOD，呈蓝绿色，主要存在于真核细胞的细胞浆内，分子量在32000左右，由两个亚基组成，每个亚基含一个铜和一个锌。第二种类型-Mn-SOD，呈粉红色，其分子量随来源不同而异。来自原核细胞的分子量约为4000,由两个亚基组成，每个亚基各含一个锰；来自真核细胞线粒体的-Mn-SOD,由4个亚基组成，分子量约为80000。第三种类型-Fe-SOD，呈黄色，只存在于真核细胞中，分子量在38000左右，由两个亚基组成，每个亚基各含一个铁。此外，在牛肝中还存在一种-Co・Zn-SOD。自从1973年Weisiger等在鸡肝中发现二种SOD以来，至今已采用了各种分离及分析方法，成功地从各种动物肝脏及血液中，分离纯化了SOD。同时发现SOD的存在可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐射防护有关。目前临床上主要用于延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发性关节炎及放射治疗后的炎症，无抗原性，毒副作用较小，是很有临床价值的治疗酶oSOD不仅在临床上大显身手，而且近年来又被广泛的应用于日用化工行业。含有SOD的化妆护肤品，对抗衰老及去除脸面雀斑等有显著作用。添加SOD的化妆护肤品倍受女士的青睐，其产品具有很强的竞争力。如市场上销售的奥琪、大宝、紫罗兰、永芳等高级护肤化妆品，都因添加了SOD而成为抢手货。随着SOD被广泛应用于护肤霜、洗面奶、香皂等领域及活性氧、疾病诊断和抗辐射等方面的研究，SOD将成为广大药厂和日用化工厂的重要原料。目前我国大规模生产SOD厂家屈指可数，市场需求量大，在今后一段时间内供应将趋紧，因此充分利用动物废弃物，生产SOD是大有发展前途的。（一）原料及试剂：1、 牛血或猪血：动物血液一定要保证新鲜，无污染。2、 氯化钠：白色立方晶体或细小结晶粉末。相对密度2.165，熔点801°C。味咸，中性。有杂质时易潮解。溶于水和甘油，难溶于乙醇。这里用于配制生理盐水，选用一级工业品。3、 乙醇：又称酒精，无色透明易挥发、易燃的液体。有酒味和刺激辛辣滋味。相对密度0.789。沸点78.4C。溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸湿性，能与水形成共沸混合物。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物。这里作溶剂用，选用工业乙醇。4、 丙酮：无色易挥发、易燃液体。有微香气味。相对密度0.7893，沸点56.5C。于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶。能溶解油、脂肪、树脂和橡胶。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物，化学性质活泼。这里作溶剂用，选用工业丙酮。5、 氯仿：又称三氯甲烷。无色透明易挥发的液体。稍有甜味。相对密度1.49，沸点61.2C。不易燃烧，微溶于水，溶于乙醇、乙醚、苯、石油醚等。在光的作用下，能被空气中的氧氧化成氯化氢和剧毒的光气。这里用作溶剂，选用化学纯试剂。6、 磷酸氢二钾（^HPO/—磷酸二氢钾（^PO4）缓冲液：配制方法如下：（1） 2.5微摩尔/升磷酸氢二钾溶液的配制：一般市售的化学试剂其分子式为K2HPO4・3H2O,称取0.569克溶解在1000克蒸馏水中，搅拌均匀。（2） 2.5微摩尔/升磷酸二氢钾溶液的配制：如市售的化学试剂其分子式为KH,PO4,则在1000克蒸馏水中加入0.34克，搅拌均匀。如果分子式为KH2PO4・2H2O，则在1000克水中加入0.43克，搅拌均匀。（3）缓冲溶液的配制：按上述方法配好2.5微摩尔/升磷酸氢二钾溶液和2.5微摩尔/升磷酸二氢钾溶液后，将磷酸二氢钾溶液缓缓地倒入磷酸氢二钾溶液中，直至调整溶液的pH值至7.6为止。（4）50微摩尔/升磷酸氢二钾—磷酸二氢钾缓冲液的配制：完全照（一）.6之（1）~（3）项进行，只是分别将磷酸氢二钾、磷酸二氢钾的量加大20倍即可。7、 DEAE-SephadexA-50：它的全称为二乙胺乙基葡聚糖凝胶离子交换剂，具有离子交换和分子筛的双重作用。其结构多孔、疏松，非特异性吸附很少，层析流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化以及生化制剂的除热原。DEAE-SephadexA-50是一种阴离子交换剂，各地生化试剂商店均有出售。用前应预先处理，首先将它溶于水中（或5~10倍量洗脱剂中），最好将干胶往水里加，边加边搅拌，以防凝胶结块。在室温放置，完全水化后，再用水反复洗3~4次，同时沥去水面上漂浮的细粉，用抽气漏斗抽干。将抽干的胶浸泡于0.1摩尔/升的氯化氢溶液中20分钟，滤去氯化氢溶液，用水洗至中性。再用0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液浸泡20分钟，滤去氢氧化钠溶液，用水洗至中性。最后再用0.1摩尔/升氯化纳溶液浸泡20分钟，滤去酸液，用水洗至中性，然后用磷酸缓冲液浸泡平衡即可使用。交换剂使用多次后吸附量降低，可按上述方法处理一遍，以保证交换剂的交换能力不降低。8、 柠檬酸三钠（Na3C6H5O7・2H2O）：又名枸橼酸钠。无色晶体或粒状粉末。相对密3 6 5 7 2度1.875。150°C时失去结晶水，温度再高则分解。溶于水，难溶于乙醇。这里作抗凝剂用，选用化学纯试剂。（二）从牛血中提取SOD：1、加热除杂蛋白工艺流程： 血浆（供制备凝血酶用）新鲜牛血（分离血球）—-血球一（提取 ”沉淀（弃去）»上清液（弃去）•上清液匕沉淀（沉淀）*上清液（回收丙酮）（沉淀） 杂质（弃去）沉淀（溶于磷酸钾缓冲液） 八、 上清液透析液（浓缩干燥）产品（DEAE-SephadexA-50透析液（浓缩干燥）产品2、操作步骤：（1） 分离血球：取新鲜牛血，按100千克牛血加3.8克柠檬酸三钠投料，搅拌均匀，装入离心管中，在离心机中以3000转/分的速度离心15分钟，收集血球，血浆可用于制备凝血酶。（2） 提取：把收集的血球用0.9%氯化钠溶液洗三遍（每次用血球2倍体积的氯化钠溶液），然后加入蒸馏水（和牛血等量的水），在0〜4°C条件下，搅拌溶血30分钟，再缓慢加入溶血的血球0.25倍体积的95%乙醇和0.15倍体积（相当于溶血的血球而言）的氯仿（乙醇和氯仿要事先冷却至4C以下），搅拌均匀，静置20分钟，至离心机中离心30分钟，收集上清液，弃去沉淀。（3） 沉淀：在上清液中加入2倍体积的冷丙酮，搅拌均匀，于冷处静止20分钟，离心收集沉淀。沉淀物用1—2倍体积的水溶解，在55C水浴中保温15分钟，离心收集上清液,再用2倍冷丙酮使上清液沉淀，静置过夜。然后离心收集沉淀，上清液可回收丙酮。（4）DEAE-SephadexA-50分离纯化：把以上沉淀溶于pH值为7.6、2.5微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，用离心法除去杂质，收集上清液准备上柱。先把DEAE-SephadexA-50装入3X40厘米的柱中（即柱长40厘米，柱内径3厘米），用pH值为7.6、2.5微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液上柱，等流出液的pH值为7.6时，然后将样品上柱，用pH值为7.6、2.5微摩尔/升~50微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液进行梯度洗脱（洗脱液浓度从2.5微摩尔/升开始逐渐加大至最终浓度达50微摩尔/升，这样便形成一个洗脱梯度），收集具有SOD的活性峰，将洗脱液倒入透析袋中，在蒸馏水中进行活性透析（透析方法是利用小分子物质在溶液中通过透析袋，而蛋白质和粘多糖等大分子不能通过透析袋的性质而达到不同大小分子分离的一种方法），然后将透析液经超滤浓缩后，冷冻干燥即为SOD产品。3、磷酸氢二钾法工艺流程：亠 一血浆（用于制备凝血酶）新鲜牛血（分离血球）―血球 （提取一*沉淀（弃去）一下层液（回收氯仿）■上清液 （萃取）—上层液 上清液（回收丙酮）*杂质（弃去）*杂质（弃去）*清液 —沉淀（溶于磷酸钾缓冲液）（DEAE-SephadexA-50分离纯化）*洗脱液A-50分离纯化）*洗脱液*透析液（超滤和冻干）产品4、操作步骤：（1）分离血球：取新鲜牛血，加入3.8%柠檬酸三钠溶液（按100千克牛血加3.8克柠檬酸三钠），搅拌均匀，装入离心管中，以3000转/分的速度离心15分钟，收集血球。血浆可用于制备凝血酶。（2）提取：首先用0.9%氯化钠溶液洗血球三遍，每次用血球2倍体积的氯化钠溶液，然后加入等体积蒸馏水搅拌溶解30分钟（0〜4°C）。再缓慢加入溶血的血球0.25倍体积95%冷乙醇和0.15倍体积的冷氯仿（4C以下），搅拌15分钟，静置20分钟，用离心法收集上层清液。（3） 萃取：在离心的上清液中，加入上清液40%重的K2HPO4,搅拌使K2HPO4充分混匀，然后倒入分液漏斗中分层，收集上层溶液。（4） 沉淀：将萃取分出的上层溶液倒入塑料桶中，加入2倍冷丙酮，搅拌均匀，静置20分钟，离心收集沉淀。（5）DEAE-SephadexA-50分离纯化：把沉淀溶于pH值为7.6、2.5微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，然后离心分离出上清液。将上清液上DEAE-SephadexA-50柱（3X40厘米），用pH值为7.6、2.5微摩尔/升〜50微摩尔/升的K,HPO4-KH2PO4缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD的活性蛋白峰。然后将洗脱液装入透析袋中在水中透析，最后将透析液超滤浓缩、冻干即得微带蓝绿色产品。三）从猪血中提取SOD1、工艺流程：”黄色血浆（用于制备凝血酶）新鲜猪血新鲜猪血（分离血球）（除血红蛋白）*血红蛋白（弃去）4清液（弃去）•离心液（沉淀）»沉淀（弃去）冷丙酮（除血红蛋白）*血红蛋白（弃去）4清液（弃去）•离心液（沉淀）»沉淀（弃去）冷丙酮、、、（执变）-沉淀（执变丿"上清液（回收丙酮） 上清液-*杂质（弃去）*沉淀（溶于磷酸钾缓冲液）（磷酸柱缓离液洗脱）洗脱液（磷酸柱缓离液洗脱）洗脱液 清液 *透析液（浓缩’干燥）》产品2、操作步骤：（1） 分离血球：取新鲜猪血，事先加入猪血体积1/7的3.8%柠檬酸三钠溶液，搅拌均匀，以3000转/分的速度离心15分钟，除去黄色血浆，收集红血球。（2） 除血红蛋白：红血球用两倍0.9%氯化钠溶液离心洗涤三遍，然后向洗净的红血球加入等体积去离子水，剧烈搅拌30分钟，于0〜4°C静置过夜。再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，搅拌15分钟左右，静置30分钟，然后用离心法除去沉淀，收集微带蓝色的清澈透明粗酶液体。（3） 沉淀：向上述粗酶液中加入等量冷丙酮，搅拌均匀，即有大量白色沉淀产生，静置30分钟，用离心法收集沉淀物。（4） 热变：把沉淀溶于pH值为7.6、2.5微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液中，加热到55〜65C，恒温20分钟，然后迅速冷却到室温，离心收集上清液，弃去沉淀物。在上清液中加入等体积的冷丙酮，静置30分钟，离心分出沉淀，脱水干燥即得粗品，可用于化妆品或食用SOD。（5） DEAE-SephadexA-50分离纯化：把沉淀用pH值为7.6、2.5微摩尔/升的K2HPO4-KH2PO4缓冲液溶解，用离心法除去杂质，上清液上DEAE-SephadexA-50柱，用2.5微摩尔/升〜50微摩尔/升K2HPO4-KH2PO4缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD的活性峰。将洗脱液装入透析袋中，在蒸馏水中透析，超滤浓缩透析液，然后冷冻干燥即得精品。（四）注意事项：（1） 牛血SOD对热稳定，猪血SOD对热敏感。因此在分离过程中温度应控制在5C左右，最好在0C,时间不要超过4天。（2） 分理出的红血球经生理盐水洗涤后，如暂不用，可冷冻保存，不影响其酶活力。（3） 上柱分离纯化要注意pH值和盐浓度，pH值控制酶分子的带电状态，盐浓度控制结合键的强弱。为了得到高纯度的SOD，常采用梯度洗脱（详见附录），也可以用DE-32、CM-32等作为交换剂。（4） 有机溶剂用量应掌握适当比例，在有机溶剂存在下，可有效的沉淀蛋白质，但应当控制适当温度，方得到最佳分离效果。（5） 牛血SOD在pH值为5.3〜9.5范围内比较稳定，猪血SOD在pH值为7.6〜9范围内比较稳定，因此在提取过程中应注意掌握SOD酶的最合适的pH值。（五）SOD活性及纯度检验:1、 SOD活性检验：SOD活性检验比较经典的方法是黄嘌吟氧化酶一细胞色素C法，简称CytC法：本法主要是有氧条件下，黄嘌吟氧化酶催化黄嘌吟或次黄嘌吟发生氧化反应生成尿酸，同时产生超氧阴离子，氧化型高铁CytC被超氧阴离子还原成亚铁CytC。后者在550纳米波长处有最大吸收。SOD抑制超氧阴离子对高铁CytC的还原，因而测定高铁CytC在加入SOD前后速度变化，可计算SOD的活力。在特定条件下引起高铁CytC还原速度50%的抑制所需SOD的量定为1个活力单位。实验的条件为：高铁CytClO微摩尔/升，黄嘌吟50微摩尔/升，EDTA100微摩尔/升，磷酸钾缓冲液50微摩尔/升，pH值为7.8，反应温度25°C，黄嘌吟氧化酶必须过量（5微摩尔/升）使CytC的吸收度变化为0.025/分。本测定法是最早建立的一种SOD分析方法，至今仍被认为是一种可靠方法，不要求特殊仪器。2、 SOD纯度检验：SOD纯度可用聚丙烯酰胺凝胶电冰来测定其纯度，看其在分子量32000左右的一条带是否同标准品相同。六）生产设备:离心机1