下丘脑室旁核gabaa受体

下丘脑室旁核gabaa受体

内毒素（eps）是革兰氏阴性培养基的主要成分。作为免疫抑制剂，它经常被用作身体免疫反应的手段。这是研究免疫、神经系统之间信息交流的一般动物模型。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,通过与GABA受体结合而发挥功能。GABA受体分为A、B、C三个亚型。GABAA受体是三者中最为重要的一种,目前研究也最深入。根据以往的研究,GABAA受体广泛存在于脑内,它属于配体门控离子通道受体,是由镶嵌于神经细胞质膜双脂层中的5个亚基组成的五边形异质性多肽类寡聚体,其中心部位形成一个直径为0.5nm的GABA门控Cl-通道,当GABA与该受体结合后,可以增加细胞膜对Cl-的通透性,使Cl-内流,胞膜超极化,兴奋性降低,形成抑制性突触后电位,介导脑内大多数快速突触抑制。脑内GABAA受体最常见的是由2α、2β、1γ亚单位组成的五聚体,其中由GABAA受体α1亚单位(GABAARα1)介导的抑制功能十分重要。本实验中选用观察α1亚单位的变化来探讨GABAA受体的变化。下丘脑是重要的皮质下中枢,在维持机体内环境的平衡中起重要作用。室旁核(PVN)是下丘脑内的重要核团,不仅参与水盐平衡、血压稳定、生殖机能等的整合,而且也参与各种应激反应的调节。以往的研究表明,在PVN内有GABAARα1阳性神经元;LPS刺激引起PVN神经元表达早期即刻基因表达产物Fos。这些结果说明PVN内的神经元参与由LPS激发的免疫应激反应的调节。然而,PVN内参与应激反应的神经元是否包括GABAARα1阳性神经元,目前尚缺乏直接的证据,弄清这个问题对阐明GABA及其受体在下丘脑对免疫应激反应中的影响具有重要意义。早期即刻基因表达产物Fos被认为是神经元活动状态的标记物,可被各种刺激诱导表达。本研究在建立LPS诱导大鼠免疫应激模型的基础上,通过免疫荧光双标技术观察了PVN内GABAARα1阳性神经元与Fos表达的关系,探讨了GABAARα1阳性神经元在神经免疫调节过程中的作用。材料和方法1.饲养环境及饲养时间健康成年雄性SD大鼠12只,体重200~250g,由第四军医大学实验动物中心提供,购入后置于安静、室温(25℃左右)、避强光和自由摄食的环境中饲养48h,注意避免非特异性应激反应的发生。将动物随机分为实验组6只(腹腔注射LPS)和对照组6只(腹腔注射等剂量的生理盐水)。2.间脑连续冠状切片晨8点于大鼠清醒状态下,实验组迅速由腹腔注射300μl生理盐水溶解的LPS(250μg/kg;Sigma),对照组注射等剂量的生理盐水。两组动物在上述相同环境中放置3h后,过量1%戊巴比妥钠(>40mg/kg)深度麻醉,迅速开胸经左心室至升主动脉插管,先以100ml生理盐水洗去血液,继用含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4,4℃)先快后慢灌流固定,取出全脑置于相同的灌注液中后固定4~6h,然后将材料移至含30%蔗糖的PB内,4℃保存直至组织沉底。恒冷箱切片机切制含PVN的间脑连续冠状切片,片厚30μm,切片分5套,收集于盛有0.01mol/LPBS的网格内;用PBS洗3次,每次10min;取其中2套切片分别做Fos/GABAARa1双标及对照实验,其余于4℃冰箱内保存备用。3.免疫组化处理将兔源性Fos抗体(Sigma,1∶500)和山羊源性GABAARα1抗体(SantaCruz,1∶500)用含1%小牛血清白蛋白和0.1%TritonX-100的0.01mol/LPBS稀释后,室温下孵育切片过夜;用PBS洗3次,每次10min;然后用TexasRed交联的驴抗兔IgG(Chemicon;1∶500)和FITC交联的驴抗羊IgG(Chemicon;1∶500)混合液孵育切片2h;用PBS洗3次,每次10min;将组织切片贴于载玻片上,自然凉干,用含50%甘油的PBS封片。在激光共聚焦显微镜(OlympusFV1000)下观察并采集图像。4.表达蛋白的表达在对照试验中除了一抗用正常的血清白蛋白代替外,其他程序和上面描述的一样,正常血清孵育的组织片上检测不到Fos和GABAARα1阳性神经元。5.各类神经元的计数PVN的定位参照Paxinos和Watson的脑立体定位图谱(Fig.1),在PVN内侧小细胞部(PaMP)、外侧大细胞部(PaLM)、腹侧部(PaV)和背内侧帽(PaDC)分别计数各类神经元的数量。每例动物取前、中、后3张切片,计数每组动物所有切片上PVN内Fos、GABAARα1、Fos/GABAARα1阳性神经元的总数,再求平均值,用SPSS13.0对组间差别进行t检验,两组数据以均数±标准差表示,P<0.05表示差异有统计意义。结果1.两组gabar1阳性神经元的分布情况在对照组和LPS组的PVN内均能观察到GABAARα1阳性神经元(Fig.2A,D)。GABAARα1神经元发出明亮的绿色荧光,阳性产物见于细胞膜和胞浆内,神经元呈绿色,细胞轮廓清楚,胞核未染。细胞形态多样,有三角形、梭形、椭圆形及不规则形等,直径约10~20μm。GABAARα1阳性神经元主要分布在PaV,PaMP内仅有一定数量的分布,PaLM和PaDC分布较少。虽然LPS组的GABAARα1阳性神经元数较对照组稍多,但两组之间的差异没有统计学意义(P>0.05,表1)。在LPS组(Fig.2D),部分GABAARα1阳性神经元荧光亮度更强。2.大鼠pvn的表达在LPS腹腔注射组的PVN内能观察到大量Fos阳性神经元。Fos阳性神经元发出明亮的红色荧光,阳性产物限于胞核内,深染,圆形,边缘光滑。Fos阳性神经元主要密集分布于PVN的PaMP,PaV内有中等量分布,而PaLM和PaDC分布较少(Fig.2E)。对照组大鼠PVN内仅有散在分布的少量Fos阳性神经元(Fig.2B)。LPS实验组的Fos阳性神经元数量显著增多,常是对照组的数倍,两组比较差异显著(P<0.01,表1)。3.双标神经元的形成在Fos和GABAARα1双标染色的切片上,可以看到以下3种类型的阳性神经元:Fos阳性神经元、GABAARα1阳性神经元和Fos/GABAARα1双标神经元;双标神经元特点为在同一神经元内,胞浆标记绿色荧光(GABAARα1),而胞核标记红色荧光(Fos)(Fig.2G)。在对照组的PVN内,双标神经元的数量极少,散在分布(Fig.2C);但LPS组的PVN内可见到双标神经元,且数量较对照组明显增多(Fig.2F,P<0.01,表1);双标神经元主要分布于PaV,与PaMP紧邻的PaLM内也有一些双标神经元。双标神经元约占Fos阳性神经元总数的27%,占GABAARα1阳性神经元的32%。pvn表达参与了lps刺激的免疫应激反应在神经免疫调节的研究中,常将下丘脑作为研究焦点,PVN是其中重要的核团之一,在下丘脑-垂体-肾上腺轴中起关键作用。有作者认为PVN是免疫和应激反应的重要整合中枢。腹腔注射LPS是模拟机体免疫应激状态简单而成熟的方法,可使机体免疫反应在2h达到高峰,并持续2~5h。腹腔内给予LPS的刺激信号可能主要经过两条途径进入中枢神经系统,其一是LPS诱导增多的细胞因子可使迷走神经兴奋,通过内脏传入通路,影响下丘脑等脑内其他核团的活动;其二是细胞因子(如TNF-α、IL-1、IL-6等)通过血脑屏障进入脑内,直接作用于PVN神经元。本实验观察到腹腔给予LPS刺激后可使PVN内Fos表达明显增多,与以往的报道基本一致,它可能是通过上述两条途径激活了PVN内的神经元。本实验观察到Fos阳性神经元主要密集分布于PVN的PaMP和PaV,提示在LPS刺激下,PVN的上述特定区域的神经元功能活动增强,参与了由LPS诱导的免疫应激反应。在下丘脑-垂体-肾上腺轴中,GABA是PVN内最主要的抑制性神经递质,形态学研究表明PaMP内的突触有近半数的是GABA能的。药理学证据显示GABAAR协同剂或拮抗剂作用于PVN可以影响急性应激反应时肾上腺皮质激素的分泌,表明PVN至少有GABAAR。本研究结果显示PVN内有许多GABAARα1阳性神经元,特别是在PaMP和PaV,这些结果也和以往研究GABAA受体的免疫组化和mRNA的分子杂交结果基本一致。我们进一步观察到腹腔注射LPS后,大约32%的GABAARα1阳性神经元同时显示Fos标记,说明GABAA受体在LPS诱导的免疫应激反应中起重要作用。由于PVN内,特别是PaMP和PaV内促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)阳性神经元大部分表达GABAARα1,所以在LPS诱导的免疫应激反应中,GABA是通过抑制CRH阳性神经元发挥作用,其意义在于通过抑制下丘脑-垂体-肾上腺轴的活动,从而减轻机体对LPS刺激的过强反应,维持机体内环境的稳定。本研究的结果为此提供了形态学依据。虽然GABAARα1阳性神经元与Fos阳性神经元的分布区域主要在PaV和PaMP重叠,并有一定数量的