猪下丘脑内瘦素长形受体mrna的分布定位

猪下丘脑内瘦素长形受体mrna的分布定位

瘦素，也被称为瘦蛋白和胖蛋白，是由脂肪细胞产生的含有167个氨基酸的蛋白质。其具有激素的作用,参与调节动物的摄食、能量代谢、生长、繁殖、内分泌和免疫功能。leptin通过其受体发挥调节作用。据报道leptin受体(OB?R)有a、b、c、d、e、f6种剪接体,其中OB-Rb为长形受体,其余的为短形受体。只有OB-Rb具有信号转导功能,为功能性受体,主要分布于脑内。近年来对人、啮齿类、羊、鸡和猪脑内OB-Rb的分布和发育学变化以及与某些神经肽的共存关系已有报道。啮齿类和羊下丘脑内OB-Rb主要分布于下丘脑弓状核、背内侧核、腹内侧核、室旁核、视上核、下丘脑外侧区和腹侧乳前核等。但未见有关猪下丘脑内OB-RbmRNA表达神经元分布定位的研究。本实验用体外转录方法合成了OB-Rb反义和正义RNA探针,用原位杂交法研究了猪下丘脑内OB-RbmRNA表达神经元的分布定位,为研究OB-Rb与其他神经肽的相互关系、探讨leptin作用的部位及其生理功能提供了形态学资料。1材料和方法1.1实验动物2～3月龄健康长白三元杂交母猪5头,购自南京象山种猪场。1.2试剂与试剂盒QIA快速胶回收试剂盒、pGEM?TEasy载体试剂盒、T4?DNA连接酶,均购自Promega公司。地高辛RNA标记试剂盒、原位杂交显色试剂,购自宝灵曼公司。原位杂交试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Trizol、逆转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、EcoRⅠ酶、ApaⅠ酶、SacⅠ酶等试剂购自上海生物工程公司。1.3rt?pcr法合成所需基因在检测colijm的表达用Trizol法提取105日龄长白母猪下丘脑总RNA。根据GeneBank上登录的猪leptin长形受体基因序列(GI3661588),在其保守区设计一对引物,由上海植物生理研究所合成。引物1:5′?CCTCCAGGAGAGCTGTTCAC3′(+3360至+3379)。引物2:5′?GGCTCTTGAAGGCTTTCTCA3′(+3683至+3702)。用RT?PCR法合成和扩增cDNA,可获得一条343bp的目的片段。PCR反应条件为94℃3min,94℃30s,54℃30s,72℃30s,30个循环,最后72℃延伸5min。用QIA快速胶回收试剂盒回收纯化PCR产物,通过TA克隆,将PCR产物直接连接到pGEM?TEasy载体上,然后转化到E.coliJM109感受态细胞中。随后,对重组质粒进行筛选、提取、纯化和鉴定(由上海生物工程公司进行测序鉴定)。对测序鉴定正确的重组质粒进行扩增、提取,用ApaⅠ酶或SacⅠ酶使之完全线性化后,用地高辛RNA标记试剂盒合成Ob-RbcRNA探针。用斑点杂交实验检测合成的正义和反义探针浓度。-20℃保存备用。此外,也可购买武汉博士德生物工程有限公司Ob-Rb寡核苷酸探针。1.4原始位异交1.4.1l-1-o-1pbs的制备将实验猪用200g·L-1的氨基甲酸乙酯5mL·kg-1腹腔注射麻醉,用含40g·L-1多聚甲醛的0.1mol·L-1PBS经颈总动脉灌注。固定后取出下丘脑,置同一固定液中后固定4～6h,然后浸入200g·L-1的蔗糖PBS中至组织块沉底。作厚20μm的冰冻切片,裱贴至用多聚赖氨酸预处理过的载玻片上,室温干燥。1.4.2切片的制备切片置37℃烘箱干燥过夜后,按以下方法进行杂交反应:①杂交前预处理:切片顺次经过0.1mol·L-1甘氨酸、3μL·mL-1的TritonX100、1μg·mL-1蛋白酶K(37℃水浴,30min)、40g·L-1多聚甲醛、0.25%(体积分数)的乙酸酐、2×SSC(柠檬酸三钠氯化钠)等溶液。②预杂交和杂交:切片在预杂交液中预杂交(43℃)30min,然后在杂交液中杂交过夜(43℃,16h),杂交液中含地高辛标记的Ob-Rb反义探针(0.5μg·mL-1)。③杂交后处理:切片顺次经过递减浓度的SSC,其中2×SSC含RNaseA(20mg·L-1);然后在碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体溶液(1∶1000)中孵育4h(室温)。④显色:切片在硝基四氮唑蓝(NBT)和5溴4氯3吲哚基磷酸(BCIP)混合液中显色过夜(4℃)。然后干燥、透明、封片,明视野下观察结果、照像。对照实验:杂交液中含地高辛标记的Ob-Rb正义探针(0.5μg·mL-1)或不加任何探针,其余步骤均相同,结果为阴性。2结果2.1rt？pcr产品的电泳结果提取的下丘脑总RNA经反转录后进行PCR扩增,得到340bp左右的扩增片段(图1),这与设计的RT?PCR产物大小一致。2.2岩石清髓基因片段的选择从电泳结果(图2)可以看出,重组质粒条带清晰,说明纯度较高;EcoRⅠ酶切片段约340bp,与预计插入的目的基因片段基本一致;ApaⅠ酶和SacⅠ酶线性化cDNA完全。2.3关于优质粒序列的测定重组质粒经DNA序列测定,与已报道的猪Ob-Rb基因序列(GeneBank,GI3661588,+3360至+3702)完全一致。2.4标记神经元/胞核型dnaob-rbmna由图4可见,含Ob-RbmRNA的标记神经元呈蓝褐色或黄褐色,广泛分布于下丘脑,在下丘脑弓状核(漏斗核)、腹内侧核、背内侧核、室旁核、室周核出现大量的标记神经元,可见这些核团内的多数神经元含有Ob-RbmRNA;在下丘脑外侧区也发现许多散在的标记神经元。标记神经元呈现多种形态,有多边形、三角形、卵圆形等。在典型的Ob-RbmRNA标记神经元,胞核清楚,色浅,胞质深染,特别是核周区染色较深。说明Ob-RbmRNA主要位于胞质中,近核区密度较大。在使用Ob-Rb正义核酸探针或不加探针的对照实验中,上述结构中仅见背景染色,未见明显的Ob-RbmRNA标记神经元。3猪瞳内ob-rb基因表达从RT-PCR产物、重组质粒和酶切鉴定电泳结果及重组质粒序列测定结果可以看出,本实验用体外转录方法合成的Ob-RbmRNA探针与设计的探针大小一致,与GeneBank上登录的猪Ob-Rb基因序列完全相同,说明探针具有高度的特异性。Ob-Rb在脑内的分布定位,特别是在下丘脑特定核团的分布定位以及与其他神经肽的关系,是近几年生命科学研究的热点之一。MercerJG等人报道,Ob-R和Ob-RbmRNA在小鼠下丘脑弓状核、腹内侧核、室旁核和腹侧乳前核高度表达,在下丘脑背内侧区和外侧区也有表达。BaskinDG等人发现,Ob-Rb阳性细胞在弓状核和腹内侧核丰富,在背内侧核和室旁核较少。YamamotoS等人报道,leptin受体样免疫活性在下丘脑,特别是室旁核和视上核分布广泛。WilliamsLM等人发现,Ob-Rb基因在绵羊视前区、室旁核、腹内侧核和弓状核表达。还有不少研究者证明,在人和猪下丘脑均有Ob-RbmRNA分布。本实验结果表明,猪下丘脑内的Ob-RbmRNA主要分布于丘脑弓状核、腹内侧核、背内侧核、室旁核、室周核,也见于下丘脑外侧区。本文的结果与在啮齿类、人和羊上获得的结果基本一致,但也有一些差异,如作者在室周核观察到Ob-Rb基因的表达,但未在视上核和乳前核观察到Ob-Rb基因表达。这些结果的异同,反映Ob-Rb的基因表达存在种间差异,但也不排除实验方法的差异。本文结果进一步肯定了前人的研究结果,弥补了猪下丘脑内leptin长形受体mRNA表达神经元的分布定位资料的空白,为理解Leptin的生理功能提供了形态学基础。从本文结果可以看出,猪下丘脑Ob-RbmRNA分布的核团,主要是一些参与调节内脏功能活动的核团。文献报道,在这些核团内含有生长抑素(SS)、前阿黑皮素(POMC)、神经肽Y(NPY)、胆囊收缩素(CCK)、蛙皮素(bombesin)、促黄体激素释放激素(LHRH,GnRH)、促