活性氧在肾血管性高血压大鼠中的作用及机制

活性氧在肾血管性高血压大鼠中的作用及机制

过度高血压的特点之一是血压的重要特征之一。许多研究表明，核电站或后续高血压患者及其各种患有高血压的模型动物的交感神经活动显著增加，这在高血压的发生、发展和靶器官损伤中发挥了重要作用。通常交感神经活动受中枢神经系统调控,最新研究表明中枢活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)与高血压时交感神经活动增强密切相关。下丘脑室旁核(paraventricularnucleus,PVN)是整合心血管活动的重要核团,其下行纤维投射到延髓头端腹外侧区(RVLM)和脊髓中间外侧柱(IML),进而调控交感节前神经元和心血管活动,PVN功能异常可能是导致高血压时交感神经活动增强的重要原因之一。现通过改变PVN中ROS的含量探讨PVN中ROS与肾血管性高血压交感神经过度增强的关系,从而寻找降压作用明显的分子靶点;通过干预这些靶点观察减少PVN中ROS含量的药物对高血压的治疗效果,为防治高血压提供科学的实验和理论依据。1材料和方法1.1动物饲养管理健康成年♂SD大鼠40只,体重180～200g,普通级,由安徽省长临河医药科技有限公司提供,动物分笼饲养,自由摄食和饮水,通风良好,室温18～25℃,12h光照昼夜循环。1.2xsd-100滨水处理系统68003型单臂数字式立体定位仪、Strong90式颅骨钻(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);powerlab8/30数据采集分析处理系统(澳大利亚ADInstruments公司);XSD-100体式显微镜(蚌埠光学仪器厂);U型银夹及无创血压测定分析系统(ALC-NIBP,上海奥尔科特公司)。1.3聚合物和二甲基亚α-氯醛糖、4-羟基-2,2,6,6-四甲基氧基哌啶(Tempol)、二乙基二硫代氨基甲酸银(DETC)、4-羟基-3-甲氧基苯乙酮(APO)、氯化二亚苯基碘嗡(DPI)、二甲基亚砜(DMSO)均购于Sigma公司;乌来糖、苯酚、氯化钠均为市售国产分析纯。配制微量注射试剂Tempol、APO、DPI用生理盐水(NS)作溶剂,DETC用1%DMSO作溶剂。1.4应激对sbp的影响实验动物在清醒状态下通过ALC-NIBP对尾动脉SBP进行检测。测量时先将动物充分固定,并将环境温度控制在28℃左右,待动物安静时方可进行。为了减少应激对SBP的影响,所有实验动物在正式检测前,均进行为期1周的训练。在假手术(Sham)或者两肾一夹(2-kidney1-clip,2K1C)手术后,每周进行1次检测,连续4周。1.5u3000结论实验动物在适应性饲养1周后进行实验,随机分成Sham组和2K1C组,每组20只,按照Goldblatt2K1C方法制作模型。用10%水合氯醛(300mg/kg)腹腔内注射麻醉,经腰部纵行切口腹膜外路径暴露动物右肾动脉,于右肾动脉上放置内径0.2mmU型银夹,使右肾动脉部分狭窄,左肾动脉保持原状。Sham组方法相同但只暴露右肾动脉,不放置银夹。术后给予青霉素20000U/100g皮下注射预防感染。术后1周开始监测尾动脉SBP,术后4周尾动脉SBP高于21.3kPa可视为造模成功。实验过程中2K1C组1只死于术后感染,1只收缩压未达到规定要求不予统计;Sham组全部存活。1.6血压检测和记录腹腔注射乌拉坦(800mg/kg)和α-氯醛糖(40mg/kg)混合麻醉,术中可根据动物的状态每小时使用约注入初始剂量的1/10的麻醉剂进行维持。分别行左颈外静脉、左颈总动脉、气管插管术以及去压力感受器的神经支配。左颈外静脉与注入混合麻醉溶液的PE50聚乙烯管连接;左颈总动脉与充有肝素生理盐水溶液的PE50聚乙烯管连接,通过压力换能器与powerlab8/30数据采集分析处理系统相连,实时记录动脉血压(ABP)、平均动脉压(MAP)和心率(HR)。去压力感受器的神经支配是通过切断双侧迷走神经,切断支配颈动脉的神经纤维,以及使用10%苯酚溶液破坏颈动脉分叉处上下各4mm范围内动脉周围结缔组织实现,若静注苯肾上腺素(20μg/kg)后MAP增加3.3kPa以上而HR变化不超过5次/min即可确认压力感受器去神经支配成功。1.7rsna基础值经腰部纵行切口腹膜外路径暴露左肾,在腹主动脉附近区域仔细游离肾交感神经,并浸入温石蜡油中,安放双臂银丝电极引导RSNA,经交/直流差分放大器放大后通过PoweLab8/30数据采集分析处理系统记录RSNA,并对RSNA进行积分处理,同步记录原始RSNA(RawRSNA)和整合RSNA(IntegratedRSNA)。通过对RSNA实际基础值占实际最大值的比例来评价RSNA的水平,可根据公式RSNA=(RSNAbaseline-RSNAnoise)/(RSNAmax-RSNAnoise)×100%计算得到。RSNAmax(RSNA最大值)通过快速静脉推注硝普钠(SNP,50μg/kg)待血压下降至8.0kPa以下并低于压力感受器的阈值时可引起RSNA反射性增加而记录到,RSNAnoise(RSNA噪音值)通过切断肾神经中枢端消除肾交感神经传出活动而记录到。1.8双侧pvn注射将大鼠头部固定于立体定位仪上,暴露前囟,根据Paxinos和Watson的大鼠立体定位图谱进行定位,行双侧PVN(前囟后1.8mm,中线旁开0.4mm,前囟下7.9mm)微量注射药物,药物每侧注入50nl,于1min内注射完毕。实验结束前再注入50nl的2%伊文斯蓝,然后断头取脑,将其放入10%福尔马林溶液中浸泡1周后脑组织切片鉴定注射位点。注射位点不在PVN范围内的实验数据不予采用。1.9观察值的分析采用SPSS16.0软件对数据进行统计分析,同一只动物前后观察值的比较采用配对t检验,两组间的比较采用独立样本的t检验,多组间的比较采用单因素方差分析并采用SNK检验做样本间的多重比较,实验数据以x¯±SEx¯±SE表示。2结果2.12尾动脉sbpkpa比较术前2K1C组和Sham组尾动脉SBP(kPa)为(18.04±0.32vs18.22±0.31),SBP相近,差异无统计学意义。从术后1周开始2K1C组尾动脉SBP比术前明显升高,随后逐渐升高并且维持在一个高水平,术后4周达到最大值;从术后1周开始2K1C组尾动脉SBP均较Sham组明显升高,尾动脉SBP(kPa)比较:术后1周(22.0±0.43vs19.24±0.24)、术后2周(21.98±0.48vs18.67±0.30)、术后3周(23.60±0.39vs18.50±0.27)、术后4周(24.32±0.33vs18.80±0.28),差异均有统计学意义(P<0.01)。而Sham组尾动脉SBP术前、术后相近,差异无统计学意义。见图1。2.22c.320.32的统计学分析2K1C组MAP(kPa)为18.99±0.32较Sham组13.38±0.34明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);2K1C组RSNA(%max)为78.23±4.40,较Sham组46.47±4.13明显增强,差异有统计学意义(P<0.01),见图2A、2B。2.3pa的统计学处理与注射NS相比,双侧PVN微量注射超氧阴离子清除剂Tempol(0.2mol/L)在2K1C组和Sham组均能显著降低MAP(kPa)分别为(-1.41±0.11和-0.41±0.05)vs(0.16±0.04和0.12±0.03),差异有统计学意义(P<0.01);减弱RSNA(%)分别为(-8.2±1.9和-5.9±0.8)vs(1.8±0.6和1.9±0.8),差异有统计学意义(P<0.01),与Sham组相比2K1C组MAP下降明显(P<0.05),而RSNA差异无统计学意义(P>0.05)。见图3A、B。2.4双侧pvn微量注射dp的比较表1与注射NS相比,双侧PVN微量注射NADPH氧化酶抑制剂APO(0.01mol/L)对2K1C组和Sham组均能显著降低MAP(kPa)分别为(-1.21±0.19和-0.60±0.08)vs(0.16±0.04和0.12±0.03),差异有统计学意义(P<0.01);减弱RSNA(%)分别为(-6.7±1.3和-4.5±0.6)vs(1.8±0.6和1.9±0.8),差异有统计学意义(P<0.01)。双侧PVN微量注射DPI(0.01mol/L)也出现类似的结果,与注射NS相比,2K1C组和Sham组均能显著降低MAP(kPa)分别为(-1.71±0.36和-0.60±0.17)vs(0.16±0.04和0.12±0.03),差异有统计学意义(P<0.01);减弱RSNA(%)分别为(-8.3±2.1和-6.9±1.8)vs(1.8±0.6和1.9±0.8),差异有统计学意义(P<0.01)。与Sham组相比,2K1C组MAP下降明显(P<0.05),而RSNA差异无统计学意义。见图3A、B。2.5两组p、srna检测与注射1%DMSO相比,双侧PVN微量注射SOD抑制剂DETC(0.1mol/L)对2K1C组和Sham组均能显著升高MAP(kPa)分别为(1.01±0.19和0.44±0.15)vs(-0.2±0.05和-0.19±0.08),差异有统计学意义(P<0.01);增强RSNA(%)分别为(7.2±0.8和5.7±0.6)vs(-3.1±0.9和-1.8±0.2),差异有统计学意义(P<0.01)。与Sham组相比,2K1C组MAP显著升高(P<0.05),而RSNA差异无统计学意义。见图3C、D。3nadph氧化酶抑制剂在正体中的作用2K1C肾血管性高血压是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)依赖性高血压,在单侧肾动脉狭窄时,因肾缺血所致的肾血流量减少,肾灌注压降低以及肾小球滤过率的降低,通过兴奋肾内的肾血管压力感受器和致密斑感受器而引起球旁颗粒细胞释放肾素,进而激活肾素—血管紧张素—醛固酮系统(RAAS),其中AngⅡ作为一种较新的缩血管物质参与高血压病的发生和发展,该研究主要探讨循环血液中AngⅡ增多引起血压升高的中枢机制。AngⅡ的中枢作用是通过与缺少血脑屏障区域的神经元如室周器(CVOs)的血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)联系在一起,并将信号传递到下游的心血管中枢(如RVLM、PVN)对血压进行调节。有研究表明中枢神经系统ROS主要来源于NADPH氧化酶,并且NADPH氧化酶的gp91phox与AngⅡ有功能性的联系,由NADPH氧化酶衍生的ROS在AngⅡ升压反应中发挥重要作用,是血压升高和维持的重要机制之一。NADPH氧化酶是由结合于膜上的细胞色素b558(gp91phox和p22phox)和细胞质基团(p67phox、p47phox、p40phox以及小G蛋白Rac)构成,当细胞受到适宜的刺激后,其细胞质的亚基可转录到细胞膜,使NADPH氧化酶激活,当体内抗氧化体系功能相对不足(如CuZnSOD、GPX其含量无明显变化)时,将会导致ROS的产生和清除失衡,继而引起ROS含量的增加。ROS是一类由氧在生物体内通过单电子还原产生的化学性质活泼的物质,包括超氧阴离子(O⋅−22⋅-)、过氧化氢(H2O2)和羟基自由基(·OH)等。ROS作为一种第二信使,在基因调节和信号转导通路等方面发挥重要的调控作用,同时ROS也参与许多疾病的病理生理过程,如细菌脂多糖的致畸作用。Sunetal发现AngⅡ增加下丘脑及脑干神经元内ROS生成,并且AngⅡ引起的神经元放电活动的增强与神经元内ROS的水平呈正相关。ROS可通过抑制延迟整流钾通道电流、增加[Ca2+]i、减少神经元GABA递质的释放等途径使神经元活性增强。本研究结果显示2K1C组术后其尾动脉SBP逐渐升高、肾神经活动也明显增强,提示中枢ROS与高血压状态下异常增强的交感神经活动密切相关。对于本实验中出现的术后1周SBP的骤然升高可能与循环血液中的AngⅡ水平升高、AT1R对AngⅡ的增敏有关。本研究通过对大鼠双侧PVN微量注射超氧阴离子清除剂Tempol、NADPH氧化酶抑制剂APO、DPI来降低PVN中ROS的水平,引起MAP和RSNA不同程度的降低,并且MAP的降低在2K1C组更为明显。但是这些药物作用的机制也不完全相同,Tempol属于稳定的、低分子量的氮杂环己烷硝基氧,是一种对细胞膜具有高通透性的两性电解质,能促进ROS的代谢并且增加NO的生物利用度,它可以与O⋅−22⋅-反应生成H2O2并将其归为SOD的类似物;而APO、DPI作用于NADPH氧化酶上