il-1、ang及其受体在应激性高血压大鼠室旁核中的表达

il-1、ang及其受体在应激性高血压大鼠室旁核中的表达

根据研究，在不同的受体条件下，大脑和其他部位的安-1水平持续增加，血管紧张素系统的活性增强，il-1mrna、il-1ramrna和il-1活性增加。当同时使用电大鼠时，脑脊液、室端核和星核的含量增加。利用针灸和大鼠足部的结合噪音刺激法，可以导致动物血压的持续增加。但电击足底应激所建立的大鼠慢性应激性高血压模型中PVN内IL-1β、AngⅡ及AT1R的改变是否参与应激引起大鼠血压升高过程,目前尚不清楚。为此,本文运用免疫组化观察下丘脑PVN在应激不同时间,IL-1β、AngⅡ及AT1R水平的变化及与血压的关系,为进一步阐明应激性高血压的中枢神经发病机制提供实验依据。1材料和方法1.1大学大学雄性Wistar大鼠36只,3月龄,体重(280±20)g,由吉林大学基础医学院实验动物中心提供。饲养温度在23℃～25℃,湿度40%～45%,自然光源,混合饲料喂养。大鼠随机分为对照组和应激组,其中对照组6只,应激组30只。1.2试剂IL-1β和IL-1β抗体购自Sigma公司,SP试剂盒购自福州迈新试剂公司,DAB显色试剂盒购自吉林博大生物技术有限公司。1.3方法1.3.1应激高血压模型应激组大鼠刺激周期为15、12、9、6、3d,每天上、下午各给予一次足底电刺激,每次2h,电流强度为2～4mA,电压输出为75～150V,脉冲间隔5～30s,波宽50～100ms,同时伴随一个噪音(80～100dB,时程50ms)刺激。凡血压比应激前高出20mmHg(大于正常血压3个标准差),且高于115mmHg者确定为应激高血压模型。对照组大鼠每天于同样时间置于相同的鼠箱,但不给应激刺激。1.3.2尾动脉收缩压测定用RBP-1型大鼠尾压心率测定仪(北京中日友谊医院)分别在施以应激刺激的前一天以尾套法测量尾动脉收缩压,以消除急性应激对动物血压的影响。1.3.3开颅主动脉灌注以20%氨基甲酸乙酯(1.4g/kg)腹腔麻醉,开胸,暴露心脏,在心尖部注射1%的肝素溶液1ml抗凝,并于左心室-主动脉插管至升主动脉,剪开右心耳,用100ml生理盐水快速灌注后,用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(0.1mmol/LPBS配制)400ml灌流约60min;开颅取脑组织放入固定液中固定6h,再浸入30%蔗糖溶液0.1mmol/LPBS(pH7.2)4℃保存。大鼠脑通过冷冻连续冠状切片,片厚40μm(隔三取一),收集于0.01mmol/LPBS中。1.3.4免疫组织和免疫切片先用PBS液漂洗3min×3次后,于微波炉内中加热至沸腾后继续加热15min修复抗原,自然冷却至室温,冲洗后擦干;滴加3%H2O2去离子水,室温下于湿盒中孵育10min,PBS冲洗;滴加封闭用正常山羊血清孵育20min,倾去勿洗;滴加特异性第一抗体覆盖组织,室温下孵育90min;PBS冲洗3min×3次;滴加生物素标记的第二抗体工作液,室温下孵育30min;每张切片加50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液,室温下孵育20min;用二甲基联苯胺(DAB)显色液避光显色5～10min;苏木素复染,冲洗返蓝;切片贴于涂有铬矾明胶的载破片上,37℃烘干过夜,常规脱水、透明、中性树胶封固。1.4相邻视野选择在OlympusBH-2显微镜高倍镜下(×200),以胞浆染成棕黄色至棕褐色判定为阳性细胞,随机选取5个相邻视野,用计数器计数室旁核IL-1β、AngⅡ和AT1R的阳性细胞数。全部数据用ˉx±s表示,采用SPSS12.0统计软件处理,组间比较采用方差分析,相关性研究采用Pearson相关分析。2结果2.1mmlpj-7.2应激组大鼠在应激前TSBP为(105.2±9.5)mmHg,应激后第3天TSBP升高至(125.8±7.2)mmHg(P<0.01),第6天升高至(142.2±12.8)mmHg(P<0.001),第9天为(138.9±11.1)mmHg。此后,较稳定地保持在这一高水平,至第15天仍为(140.6±11.7)mmHg。而对照组大鼠在假应激前后TSBP无明显改变(表1)。2.2血清蛋白及il-1、ang、at1r、l-1、il-1、il-1、il-1、il-1、il-1、il-1、il-1、ang和at1r免疫反应产物的鉴定结果高倍镜下未接受应激刺激的大鼠PVN内,可见少量散在的阳性细胞,染色浅,主要是胞膜染色。应激刺激15d的大鼠,可见大量阳性细胞,IL-1β、AngⅡ和AT1R免疫反应产物主要定位于胞质和胞膜上,各细胞染色深浅不一。免疫反应阳性细胞计数显示,IL-1β、AngⅡ和AT1R表达在第3天开始上升,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),且随着应激天数的增加,免疫反应阳性细胞数量维持在较高水平(表2)。2.3高血压il-1、ang和at1r表达水平与血压相关性分析各组IL-1β、AngⅡ和AT1R阳性细胞数与尾动脉收缩压水平的Pearson相关分析显示,相关系数分别为0.980、0.939、0.983,均呈正直线相关(均P<0.001),显示IL-1β、AngⅡ和AT1R表达水平与血压均有显著的正相关性。3应激对大鼠血压的影响及病理改变下丘脑室旁核不仅是神经内分泌的重要核团,而且在恐惧等应激刺激诱发的心血管反应中具有重要作用。大量实验研究证实,中枢多种神经递质参与应激状态下的升压反应,如SP、AVP、ACh、IL-1β、AngⅡ、NE、阿片肽等,其中中枢性IL-1β和AngⅡ在诱发并促进高血压发展过程中起着非常重要的作用。现已明确,下丘脑室旁核不仅存在有AngⅡ免疫阳性细胞及大量的AngⅡ神经纤维和末梢,而且还有IL-1β免疫阳性细胞及丰富的神经纤维投射。其中PVN是AT1R分布密度最大的核团之一,应激后PVN内c-fosmRNA表达增强,下丘脑组织中AngⅡ含量升高,IL-1β活性增强。许多研究表明,体内有多种神经递质参与慢性应激刺激引起大鼠血压升高,并在机制上互相影响、互为因果。AngⅡ和IL-1β作为重要的应激介导因子参与多种生理或病理反应。过去的研究中曾观察到急性应激刺激致下丘脑等脑区IL-1β含量增加,室旁核微量注射IL-1β可引起血压明显升高,并伴有心率加快。最近,Ufnal研究发现在预先给予IL-1β处理的大鼠,侧脑室注射阈剂量的AngⅡ可以引起血压升高,如同时给予AT1受体阻滞剂,可消除中枢应用IL-1β引起的升压反应。因此,推测由IL-1β引起平均动脉血压的升高依赖于血管紧张素的刺激。综上,随着应激的进行,血压逐渐升高,室旁核内IL-1β、AngⅡ及AT1R表达均呈不同程度的增强,尤以慢性应激期(即应激6d以上)更明显。提示电击足底结合噪声的紧张应激刺激在引起大