羊下丘脑中催产素的分布和表达

羊下丘脑中催产素的分布和表达

脑瘫不仅是一个整合内脏活动的中心，也是一个调节颅内系统的中心。动物的生殖过程受体内外多种因素的综合调控,其中起主要调控作用的是下丘脑的神经内分泌系统,即下丘脑通过分泌神经肽或细胞因子对生殖腺进行直接或间接的调控,从而控制动物的生殖活动。催产素(oxytocin,OT)是下丘脑特殊分化的神经细胞合成的九肽,具有多种功能,其中在生殖方面具有促进子宫收缩、乳腺排乳,卵泡发育和排卵,黄体形成和溶解以及调节发情周期等重要作用。在下丘脑OT定位上,对仓鼠、大鼠、人、奶山羊和树鼩的研究结果表明,合成OT的部位已由传统概念的室旁核(PVN)和视上核(SON)扩大到下丘脑的较多区域。上述报道均是研究了某种动物某一生理阶段OT的分布,尚未见到对OT在不同生殖周期奶山羊下丘脑分布的系统研究。因此,在研究了羔羊期、青年期、妊娠期奶山羊的基础上,笔者在本试验中采用特异性强、灵敏度高的免疫组化链霉素抗生物蛋白-过氧化物酶(Streptavidin-peroxidase,SP)法与原位杂交法相结合,对2岁龄的成年发情期奶山羊下丘脑中OT及OTmRNA的神经元的分布进行了研究,为进一步研究OT生理功能、调控机理及其类似物在繁殖生产和临床治疗上的应用提供了理论依据。1材料和方法1.1多聚甲醛磷酸缓冲液的制备2岁发情期关中奶山羊4只,临床健康,西北农林科技大学实验动物中心提供。对山羊颈总动脉放血致死,迅速取下头部,向颈总动脉灌注37℃生理盐水冲净血液后再灌注4℃的40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液,灌注先快后慢。取下丘脑后放入40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液后固定10～12h,再放入含200g/L蔗糖的磷酸缓冲液中,直至组织沉底。1.2第四军医大学抗鼠链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶免疫组化超敏SP试剂盒:福州迈新生物技术开发公司产品;鼠抗OT单克隆抗体:第四军医大学馈赠,工作浓度为1∶5000;牛血清白蛋白:华美生物工程公司产品。OT原位杂交试剂盒和原位杂交用盖玻片购自武汉博士德公司。焦碳酸二乙脂(Diethylpyrocarbonate,DEPC)购自西安生物有限公司。葡萄糖氧化酶和四盐酸3,3′-二氨基联苯胺(DAB):Sigma公司生产,华美生物工程公司分装。1.3切片的制备对下丘脑做连续冠状切片,片厚20μm,切片分为4套:一套用于OT原位杂交,一套用于OT免疫组织化学染色,一套用于尼氏染色,一套用作阴性对照。1.4免疫组织化学和原阶段异交染色程序1.4.1免疫法提取抗菌素切片经0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;在室温下用过氧化物酶阻断液(试剂A)孵育40min;用0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min,放入非免疫动物血清(试剂B)中,室温下孵育40min;再放入第一抗体中,室温孵育24～48h。0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;加生物素标记的第二抗体(试剂C),室温下孵育1.5h;用0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min;加链亲合素-过氧化物酶溶液(试剂D),室温下孵育1.5h,0.01mol/LPBS液(pH7.4)漂洗3次,每次10min,放入DAB显色液中呈色:硫酸镍胺醋酸缓冲液50mL,DAB0.03g用双蒸水50mL溶解过滤,两液混合,加入葡萄糖0.2g,氯化铵0.04g,最后加入葡萄糖氧化酶0.001g,呈色时间不超过30min,其间在镜下观察、掌握呈色时间。蒸馏水终止反应后,洗2次,PBS液洗2次,每次15s后进行贴片,晾干,酒精脱水、二甲苯透明,加拿大中性树胶封片。1.4.2高效液相色谱法切片经40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液(含1/1000的DEPC)室温固定20～30min后,用蒸馏水充分洗涤。切片上滴加1份300mL/L的H2O2和50份甲醇的混合液,处理30min后用蒸馏水洗涤3次。切片上滴加30g/L柠檬酸稀释的胃蛋白酶室温消化5～120s,用原位杂交专用PBS洗3次,每次5min,蒸馏水洗1次。再滴加10g/L多聚甲醛磷酸缓冲液(含1/1000的DEPC)固定10min,蒸馏水洗3次。每张切片滴加20μL预杂交液放入湿盒,在恒温箱38～42℃作用2～4h后吸取多余的液体。每张切片滴加20μL杂交液,盖上专用盖玻片并于38～42℃杂交过夜。揭掉盖玻片,用37℃左右水温的2×SSC洗涤2次,每次5min,0.5×SSC洗涤1次15min,0.2×SSC洗涤1次15min。滴加封闭液在37℃孵育30min后甩去多余液体,滴加生物素化鼠抗地高辛孵育1h后,用原位杂交专用PBS洗3次,每次5min。滴加生物素化过氧化酶孵育30min后用原位杂交专用PBS洗4次,每次5min,入DAB显色液呈色:硫酸镍胺醋酸缓冲液50mL,DAB0.03g用双蒸水50mL溶解过滤,两液混合,加入葡萄糖0.2g,氯化铵0.04g,最后加入葡萄糖氧化酶0.001g,呈色时间不超过30min。蒸馏水终止反应后,洗2次;PBS液洗2次,每次15s,酒精脱水、二甲苯透明,加拿大中性树胶封片。阴性对照试验以PBS液(pH7.4)替代杂交液,其他步骤同上。1.5阳性产物的检测将制得的切片在光学显微镜下观察记录,Motic数码显微镜拍照,用江苏捷达801形态分析软件对阳性产物进行分析,每组动物每个部位随机选取5张切片,测量阳性细胞的数目(以具有细胞核的细胞为准)、大小及平均灰度值。2结果2.1阴性反应及神经纤维OT免疫反应阳性神经元呈深浅不等的蓝黑色,多为双极神经元或多极神经元,也见单极神经元;胞体呈不规则的圆形、卵圆形、梭形、三角形和多角形等,大小不等,成堆或分散分布。背景无色或浅蓝色,反差明显,对照试验均呈阴性反应。根据反应颗粒着色的深浅可分为强阳性、中等阳性和弱阳性3种。强阳性细胞蓝黑色,胞体内深蓝色颗粒融合成团,如视上核(图1-A),室旁核(图1-B);弱阳性细胞着色浅淡,轮廓不清;中等阳性细胞介于二者之间,如结节乳头体核、下丘脑外侧区。OT阳性神经元的突起伸向第三脑室或血管(图1-C),免疫反应阳性神经纤维在第三脑室,正中隆起、视上弥散核等有较多分布(图1-D)。OT阳性细胞在下丘脑分布广泛,在19个核团(区)中具有阳性表达,在视上核、室旁核、乳头体内侧核、乳头体后核和下丘脑外侧区等分布较多,而在视上弥散核、视前交叉上核、乳头体上核及前联合核分布较少。2.2ot基因的表型含有OTmRNA阳性杂交信号的细胞呈蓝黑色,背景不着色或浅蓝色,对照组切片均为阴性。下丘脑的各个核团均呈较强的杂交信号,与OT免疫阳性产物基本一致,如视上核(图1-E)、室旁核(图1-F);与免疫组化相比,杂交的阳性细胞呈椭圆形、三角形、梭形等,但突起较少,形状以椭圆形为主。OTmRNA广泛分布在下丘脑的23个核团(区)中,在下丘脑的视上核、室旁核、腹内侧核、乳头体内侧核和乳头体外侧核分布较多,而在乳头体上核、结节乳头体核、乳头体前外侧核、后穹窿周核等分布较少。原位杂交尚未发现有OTmRNA的阳性神经纤维。2.3前脑后侧核和前脑内核分布下丘脑内OT及其OTmRNA细胞数在15个核团(区)中具有共同分布(见图2),还观察到阳性产物多存在于视上核、室旁核。其次在乳头体内侧核、下丘脑外侧区也有较多细胞分布,在视前交叉上核、前联合核、视前内侧核和视前外侧核没有OTmRNA分布,而背内侧核、下丘脑前区、室周核等8个核团(区)无OT阳性细胞分布。由下丘脑内OT及其OTmRNA灰度值在各个核团中的分布(见图3),可观察到在视上核、室旁核的灰度值较低,其次在交叉上核、乳头体内侧核、视上弥散核、结节乳头体核等核团也较低。3奶山羊金属核团中ot的表达已有的关于OT生理功能方面的研究表明,OT除在生殖活动的调节中发挥着重要作用外,对心血管功能、消化功能、体液渗透压、神经免疫也有调节作用,与应激反应、睡眠与觉醒、痛觉调制等有密切关系,并能改善母亲期长期空间记忆,增加人类之间的信任感,对精神失调和社会行为的破坏如自闭症有改善作用。生理功能的产生必定有其形态学基础,OT合成部位的研究成为该领域的热点。Monika研究发现,哺乳动物的OT神经元主要存在于下丘脑大细胞核、视上核和室旁核,其神经纤维主要投射到垂体后叶和正中隆起。段晓勤等、沈霞芬等在多种动物的室旁核、视上核、穹窿周核、室周核、下丘脑外侧区、下丘脑前核、环核和前联合核等观察到OT神经元,本试验也在上述区域观察到阳性神经元及数量不等的阳性纤维。此外,在视前内侧核、视前外侧核、视上弥散核、腹内侧核、腹外侧核等核团亦看到一定数量的神经元,出现阳性细胞部位达19个核团(区)。该结果与妊娠期、青年期奶山羊下丘脑中OT免疫反应神经元的分布相似。原位杂交试验结果表明,除了视上核和室旁核是下丘脑中表达OTmRNA的主要部位外,还在弓状核、背内侧核、下丘脑背区、下丘脑后核、下丘脑室周核等23个核团(区)中均观察到OTmRNA杂交信号,说明下丘脑的大多数核团(区)自身就能合成OT,而非来自外源性的。Wathes等在山羊发情周期的第3～6d,每天给羊皮下注射100IUOT,可以使发情周期从21d缩短到7d;Homeida等给山羊和绵羊进行OT主动免疫,结果可以使发情周期显著地延长,说明OT在发情周期中发挥着重要作用。Diana等研究表明,发情期大鼠的下丘脑中OTmRNA水平有微弱的增加,在大鼠的发情期,下丘脑中OTmRNA增多。OTmRNA的水平可被神经内分泌大细胞和投射到大鼠的下丘脑或下丘脑外区域的小细胞神经元协调调节。David等在妊娠期的大鼠下丘脑中也观察到OTmRNA增加,而分泌OT的神经元在形态和电生理方面均发生了改变。本试验结果表明,在发情期奶山羊下丘脑的15个核团(区)存在OT及OTmRNA共同分布表达,在这些核团中含有OT阳性细胞,并且细胞数量多于OTmRNA,OT在此时期多呈现强阳性表达,而OTmRNA大多呈中等阳性,这可能是OT经下丘脑大部分核团神经细胞内mRNA合成后,通过轴浆运输和血液传送到达一定的核团,并在