高原低氧大鼠下丘脑氨基酸和nadph-d的变化

高原低氧大鼠下丘脑氨基酸和nadph-d的变化

谷氨酸（glu）和天冬氨酸（asp）是中枢神经系统的刺激性转运物质。过度的中枢神经系统活动会影响中枢神经系统的功能，并导致中枢神经系统损伤。近来的研究表明谷氨酸通过作用于N-methyl-D-asparticacid(NMDA)受体引起Ca2+内流而产生一系列反应,包括cfos,一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)的表达,并发现下丘脑内源性一氧化氮(nitricoxide,NO)参与了多种神经递质的释放。本研究应用高原低氧模型及氨基酸测定、NADPH-d(nicotinamideadeninedinucleotidephosphatediaphorase)组织化学法,探讨NMDA受体的激活是否参与高原低氧后下丘脑一氧化氮合酶的表达。材料和方法一、低氧大鼠预处理实验用Wistar大鼠72只,体重150-200g。雌雄不拘。大鼠随机分为:(1)正常对照组(室温常氧);(2)高原低氧组(1,7,15d将大鼠置于模拟海拔6000m的低压舱内,舱内温度为4℃,每天6h);(3)高原低氧+氯氨酮(1d)组,用NMDA受体阻滞剂氯氨酮(ketamine,Ket,Sigma,ip,40mg/Kg)对高原低氧大鼠进行预处理,半小时后置于低压氧舱内;(4)高原低氧+AP-V(1d)组,用NMDA受体阻滞剂-(---,Sigma,i.c.v,10μg)对高原低氧大鼠进行预处理,半小时后置于低压氧舱内。每组12只,6只进行氨基酸含量测定,6只用于检测下丘脑NOS阳性神经元。二、ap-v实验大鼠以戊巴比妥钠(30mg/Kg,ip)麻醉后,固定在江湾一型脑立体定位仪上,按照Bures大鼠脑定位图谱在侧脑室(P1.5,R1.5)埋置导管一个,并用牙托粉固定,导管系用8号针头制成,手术3-5d后进行实验,注射AP-V(10μg,10μL),于1min内注完,留针4min以防药物溢出。三、glu含量的测定大鼠断头,迅速取出下丘脑,精确称重。置样品于冰镇玻管中,加入10%磺基水杨酸(1mL),冰浴下以玻璃匀浆器手动匀浆并离心(4℃,15000r/min,30min),取上清液50μL,用美国Beckman-6300黄金系列高效氨基酸分析仪检测Glu的含量。分析条件如下:柱高10cm,柱温33-60℃,锂缓冲液(Li-A),茚三酮的流速为10mL/h,比色波长为570nm。四、还原型nadph、nbt和tri能力切片入0.1mol/LPB(pH7.3)清洗后,入NADPH-d染色液[0.1mol/LPB配制,pH7.3,含0.1%还原型NADPH(B.M公司),0.01%NBT(B.M公司)和0.03%Triton-X100],37℃孵育40-60min。将切片移至0.01mol/LKPBS缓冲液中终止显色反应,明胶贴片,D.P.X封片和镜检,每一动物同一部位的下丘脑切片随机抽取张,作阳性细胞计数(整个核团),取均数作为该动物的NOS阳性细胞数,然后进行统计学分析。五、处理数据结果一、d的稳定性实验观察到大鼠下丘脑Glu、Asp的含量在低氧第1d即开始增加,7d组明显多于对照组(P<0.01),15d仍维持在较高的水平。分别用NMDA受体阻滞剂氯氨酮和AP-V对高原低氧组大鼠进行预处理,半小时后置于低压氧舱内。观察到大鼠下丘脑Glu、Asp的含量与高原低氧组相比,无显著差异(P>0.05,表1)。二、室旁核、视上核nos阳性神经元模型正常大鼠下丘脑内NOS阳性神经元分布弥散,数量较少,而高原低氧大鼠下丘脑室旁核(paraventricularnucleus,PVN)的大细胞部,视上核(supraopticnucleus,SON)有密集深染的NOS阳性神经元,室旁核的小细胞部、背内侧核、腹内侧核、弓状核、外侧区、室周区、乳头体前核可见深浅不一,疏密不等的NOS阳性细胞。从表2可以看出下丘脑室旁核、视上核NOS阳性神经元数在低温低氧1d即明显增加,7d和15d仍维持一较高的水平。用NMDA受体阻滞剂氯氨酮,AP-V对高原低氧大鼠进行预处理,半小时后置于低压氧舱内。观察到大鼠下丘脑室旁核、视上核NOS阳性神经元数明显少于相应时间的高原低氧组(P<0.01;表2,图1A,B,C,D,E,F)。no的神经调质作用大量的研究表明缺氧可致脑内氨基酸释放增加,尤其是兴奋性氨基酸递质谷氨酸、天门冬氨酸。本实验应用高原低氧模型观察到大鼠下丘脑内谷氨酸、天门冬氨酸含量明显高于正常对照组,且这一趋势能维持较长时间。缺氧引起兴奋性氨基酸递质水平的升高,主要与突触前膜的释放增加和再摄取功能障碍有关,缺氧通过干扰突触功能影响兴奋性神经元和抑制性神经元的活动。由于缺氧对抑制性突触的抑制作用更强,而致膜的兴奋性增加,膜发生去极化,兴奋性氨基酸递质大量释放入突触间隙,目前认为这是兴奋性氨基酸递质释放的主要机制。缺氧引起谷氨酸、天门冬氨酸的大量释放,可过度激活NMDA受体,从而介导了兴奋性氨基酸的神经毒性作用,通过NMDA受体激活电压门控Ca2+通道,促使Ca2+病理性内流增加,细胞内Ca2+的积聚导致神经元发生退行性改变和坏死。NO作为一种非典型的神经递质和信息分子,介导了许多与NMDA受体激活相关的生理、病理过程。大量的证据表明,NO的过量产生有神经毒性作用。NMDA受体拮抗剂有神经保护作用,目前认为ketamine的神经保护作用是由于它能较强的调节细胞内钙水平,抑制NMDA受体的过度激活,减少NO的产生,从而减轻神经元的进行性溃变和坏死。我们在实验中观察到高原低氧可使大鼠下丘脑NOS过度表达,NADPH-d组化法可见下丘脑室旁核,视上核密集深染的NOS阳性神经元,而NMDA受体拮抗剂氯氨酮和AP-V虽然不影响高原低氧引起的大鼠下丘脑Glu和Asp含量增多,但由于阻断了NMDA受体,故可翻转低氧诱导的大鼠下丘脑NOS的表达,说明缺氧引起下