大庆油田过渡带油井采出液微生物群落结构的研究

大庆油田过渡带油井采出液微生物群落结构的研究

油藏通常承受较高的压力、温度、矿化度和较低的氧化还原电位，这是一个“极端”环境。尽管缺少电子受体(氧气、硝酸盐等),油藏环境中仍然存在着复杂的微生物群落,包括硫酸盐还原菌、产甲烷菌、反硝化菌、铁细菌、发酵细菌等。这些微生物群落的变化和演替决定了微生物在油藏中的过程和作用,而对这些微生物群落的认知是对调控油藏微生物过程,开发、应用微生物采油技术的关键。在认识微生物的方法和手段中,基于培养的方法存在诸多局限,包括:大量的微生物难以培养;所检测到的微生物的相对数量随培养条件的改变而变化,因而无法准确地揭示环境中微生物群落的真实情况,因此很难对油藏中的微生物群落结构进行正确的解析。而近20年来发展的基于对微生物DNA中“生物标记(Biomarker)”进行分析的“分子微生物生态学”方法不依赖对微生物的培养,能同时检测可培养和难培养微生物,可以较为全面地解析环境中微生物的群落结构。近年来,这些方法在油藏微生物群落结构分析中开始得到应用,对加拿大低温水驱油井、美国的高温(70～75℃)且富含硫的油藏、俄罗斯的高温(60℃,85℃)油井以及我国的新疆克拉玛依注水油井的采出液和大港油田油藏微生物等的研究均表明了这些方法较基于培养的方法能得到更为全面的微生物群落结构信息。在分子微生物生态学方法中,末端标记限制性片段长度多态性(TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism,T-RFLP)分析是利用微生物基因片段序列组成的多态性,来揭示环境微生物群落的结构及其动态变化。该方法自1997年开发以来,已被广泛应用于环境微生物群落分析的研究中,具有快速、灵敏、适应于复杂微生物群落分析等特点,是研究微生物多样性和结构的一种有效而快速的手段。目前,国内在T-RFLP方法的开发和研究方面刚刚起步,主要在油田矿场微生物监测等得到了一定的应用。本研究利用对微生物群落快速、高效分析的T-RFLP技术对大庆油田油井采出液的微生物群落进行分析,试图了解大庆油田油藏采出液中微生物群落的结构、多样性和分布变化,并间接了解大庆油藏微生物群落分布特征,从而有效地指导微生物采油技术的开发和应用。1材料和方法1.1样品的u2004实验样品取自大庆油田萨北过渡带油井采出液,取样时间为2005年7月和10月(样品分别命名为GD7和GD10)。油井温度为45℃,矿化度约为4250～4750mgL-1,为水驱油井。样品采集后,迅速运送至实验室,进行DNA提取和后续分析。1.2-冻融-制备3-3,5.1,3.2,4-三唑对文献介绍的DNA提取方法进行适当修改后作为本研究的DNA提取方法。取GD7和GD10采出液油水混合样150ml,用聚碳酸酯膜(0.22μm,47mm,北京华美公司)进行真空抽滤(-0.1MPa),待水样抽干后,将滤膜取下,用无菌剪刀剪成小块,放入10ml无菌离心管;加入1mlBufferⅠ(0.15molL-1NaCl,0.1molL-1Na2EDTA,pH8),涡旋振荡,使BufferⅠ与膜充分接触;加入100μl溶菌酶(50gL-1),温育1h(37℃);将离心管放入液氮中5min后迅速移至65℃水浴锅中解冻3min,这样反复冻融3次;加入0.5mlBufferⅡ(0.1molL-1NaCl,0.5molL-1Tris-HCl,10%SDS,pH8),上下摇匀,加入5μl蛋白酶K(20gL-1),水浴1h(55℃);依据标准方法进行酚仿抽提2次,取上清液转移至新的10ml离心管中;加入2倍体积无水冰乙醇沉淀DNA,-20℃过夜,离心(13000rmin-1,30min);弃去上清液,加入1ml70%乙醇,离心(13000rmin-1,15min),弃上清液;干燥后,加入30～50μlTE缓冲溶液充分溶解DNA。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA(90V,1.5h),在溴化乙啶溶液中染色15min后用UVP成像系统检测条带。1.3荧光标记pcr对样品DNA进行适当稀释后,进行古菌和细菌的16SrDNA的PCR扩增。扩增体系和程序参见文献。古菌的扩增引物采用古菌通用引物109F(5′-ACKGCTCAGTAACACGT-3′)和915R(5′-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3′),在引物915R的5′端标记荧光物质(6-FAM)。细菌的扩增引物采用细菌通用引物8F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′),在引物8F的5′端标记荧光物质(6-FAM)。用于构建克隆文库的PCR则采用不带荧光标记的引物。PCR产物利用ChargeSwitch纯化试剂盒(Invitrogen,USA)进行纯化。1.4ssr荧光强度t-rf法对古菌和细菌16SrDNA的PCR纯化产物分别用TaqⅠ、65℃酶切3h,和RsaⅠ、37℃酶切3h;酶切产物进行脱盐后,用甲酰胺进行溶解;取3～5μl酶切产物至10μl甲酰胺中,并加入0.2μl内标Liz500(AppliedBiosystemsIncorporated,USA);将该混合物在95℃变性5min,然后迅速转移至冰上,取10μl至96孔板中,在ABI3130遗传分析仪中进行毛细管电泳;取荧光强度50RFU为基线,用Genemapper软件(AppliedBiosystemsIncorporated,USA)计算大于基线的峰高和出峰处的T-RF(TerminalRestrictionFragment,末端标记限制性片段)长度;将T-RF大于50bp的峰面积进行标准化处理,计算相对应的丰度。1.5细菌16srdna片段的pcr扩增利用非荧光标记的引物对样品GD7的古菌和细菌16SrDNA片段进行PCR扩增,采用pGEM-Teasy载体(Promega,USA)和E.coli2结果与讨论2.1生物活性化合物的扩增大庆油田萨北过渡带2005年7月和10月油井采出液古菌群落的T-RFLP图谱(图1)表明,GD7和GD10两个样品中主要有79bp、225bp、386bp3类T-RF,各自峰面积分别占总峰面积的22%、33%、25%(GD7)和9%、41%、43%(GD10)。显然,随着时间的变化,古菌群落结构发生了一些变化,T-RF为79bp型的微生物所占比例减少,而T-RF为386bp型的微生物所占比例增加。将GD7样品克隆的T-RFLP图谱与古菌群落T-RFLP图谱相比,找到对应于群落T-RFLP图谱上主要峰的相应克隆。在挑选的46个克隆中,T-RF为79bp的克隆为6个(13%),T-RF为225bp的克隆为15个(33%),T-RF为386bp的克隆为7个(15%),与在T-RFLP图谱中的3种峰所占的比例相对大小一致。根据T-RF不同,挑选相应的克隆测序,构建系统发育树(图2)。结果表明,油井采出液中古菌主要为产甲烷菌纲中的Methanomicrobials和Methanosarcinales微生物,其中克隆D4、G15、D7(T-RF386bp),D10、E13(T-RF225bp),E4(T-RF156bp),D14(T-RF113bp)分布在Methanosaetaceae科,T-RF为386bp的克隆与MethanosaetathermophilaPT相似性为99%,而T-RF为225bp的克隆E13和D9的序列虽然也与MethanosaetathermophilaPT相似性为99%,但是克隆的TaqI酶切位点不同。克隆D15、D12、E14、G6(T-RF79bp)则分布在Methanomicrobials目中,克隆D15和Genbank数据库中未培养的古菌克隆相似性为99%,而T-RF同为79bp的G6克隆则属于新的微生物物种,因为其亲缘关系最近的可培养微生物Methanomethylovoransthermophila16SrDNA序列的相似性仅为91%(表1)。2.2采出液中细菌的基因系统发育树与古菌群落相类似,随着时间变化,过渡带油井采出液中的细菌群落也发生了明显的变化,优势菌群存在显著差异:样品GD7的峰较多,物种多样性高于样品GD10(图3)。在样品GD7中,占优势的T-RF为448bp、645bp和808bp,所占总峰面积的比例分别为21%、33%和19%;而样品GD10中主要T-RF为725bp和860bp,所占比例分别为45%和20%。将GD7样品中细菌克隆的T-RFLP图谱与细菌群落T-RFLP图谱相比,找到主要峰对应的克隆。在挑选的76个克隆中,根据其T-RF大小不同分型,选取对应的克隆测序。通过克隆文库的筛选和测序,结合16SrRNA基因的进化史分析,构建油井采出液中细菌16SrRNA基因的系统发育树(图4)。结果表明,油井采出液中的细菌主要属于β、γ、δ、ε变形杆菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)和脱铁杆菌(Deferribacteres)。其中与γ和ε变形杆菌同源性相近的克隆所占比例最高,分别占21%和22%。γ变形杆菌中有三个类型的T-RF,分别为645bp、808bp和441bp,其中T-RF为645bp的克隆(B23,B27,B28,B55)与Pseudomonassp.PCP2的相似性为97%,T-RF为808bp的克隆(B3,B50)与其同源性最高的已鉴定的Nitrosococcushalophilus相似性仅为88%,T-RF为441bp的克隆(B44)与Alishewanellafetalis的相似性为97%。T-RF为448bp的克隆的序列与T-RF为454bp的克隆同属ε变形杆菌,但是T-RF为448bp的克隆(B8,B49,B14)与Sulfuricurvumkujiense相近(相似性为98%),T-RF为454bp的克隆(B11,B50)与Arcobacterspp.相近(相似性为99%)。T-RF为307bp的克隆(B59,B95)和T-RF为420bp的克隆B48则属于拟杆菌(Bacteroidetes),但是它们与其同源性最高的未培养微生物的相似性仅为95%。T-RF为77bp的克隆B16与Deferribacteres的亲缘关系最近,与从油田中分离的Flexistipessp.vp180的相似性仅为90%。T-RF为725bp的克隆B40和T-RF为176bp的克隆(B30,B42)经比对,与已知细菌的同源性均很低,仅归在环境样品的未培养微生物CandidateOP11组中。克隆B40与来自厌氧环境中的克隆相似性达96%。而克隆B30、B42和克隆B40的同源性仅为86%,这三个克隆可以聚集在一起,形成一个未知的微生物组合(Deep-BranchingCluster)”(表2)。2.3油藏微生物群落结构由于各个油藏的地质情况不同,古菌群落中的优势菌种也存在一定的差异。Orphan等在高温且富含硫的油藏中发现,该油藏中61%的古菌与Methanosarcinales中的Methanosarcinathermophila和Methanosarcinasiciliae同源关系很相近,21%的古菌与Methanosaetathermophila相似性较高,3%的古菌与Methanomicrobials中的高温菌Methanoculleusspp.相近。其中Methanosarcinals这一类产甲烷菌只能利用甲基化合物或者乙酸为碳源和能源生长,广泛存在于石油烃污染的地下水和能降解甲苯和十六烷的产甲烷菌群中,因此人们推断Methanosarcinals这一类产甲烷菌在厌氧烃降解过程中是很关键的菌群。而Methanomicrobials这一类产甲烷菌则可以利用甲酸盐、酒精或者H2+CO2进行代谢。这些产甲烷菌的存在说明在油藏环境中可能存在H2+CO2和有机酸等可供微生物代谢的电子供体。本研究结果表明,分别利用乙酸和H2产甲烷的Methanosarcinales和Methanomicrobiales微生物在大庆油藏中同时存在,二者克隆数的相对比例为48%和13%,说明这两类产甲烷菌在该油藏古菌群落中占据优势地位。在较高的分类学水平(例如科)上大庆过渡带油藏中古菌的群落多样性并不很高,与近年来人们在油藏中发现的古菌群落组成基本相同,但是在属水平则表现了一定的多样性。例如,同属于Methanosaeta的古菌可以分为2个亚组,而且每一个亚组产甲烷菌16SrRNA基因片段的酶切也不尽相同,表现出了不同的多态性。T-RFLP分析表明在2005年7月和10月,大庆油田过渡带油井采出液中古菌种类没有明显的变化,但是主要微生物的数量发生了显著的变化,从而导致了古菌群落结构的变化。对采出液细菌群落结构研究表明,在大庆过渡带油藏中的优势微生物与变形杆菌(Proteobacteria)的假单胞菌属(Pseudomonas)、硫酸盐还原菌(Pelobacter)、硝酸盐还原-硫氧化细菌(Sulfuricurvum)、反硝化细菌(Arcobacter)、脱铁杆菌属(Deferribacteres)的铁还原细菌(Flexistipes)相近。这些微生物在油藏中广泛存在,在碳元素循环和硫元素循环等能源循环中起了重要的作用。由于该油藏是水驱油藏,通常情况下,在油藏原生水和注入水中含有一些物质,如硫酸盐、碳酸盐、挥发性脂肪酸和微量元素,可作为电子受体或营养支持细菌生长代谢,并使油藏细菌群落表现出多样性。T-RFLP分析表明,不同时间细菌群落中的优势种群出现显著的变化,GD7中优势细菌与假单胞菌同源性最高(T-RF为645bp);而GD10中的优势菌T-RF为725bp,其与来自厌氧环境中的细菌克隆相似性为96%,极可能是未被发现的新细菌,对这类目前尚未培养的、在GD10中占优势的未知细菌的功能特性和生命活动规律的了解还需更加深入的研究。通常认为,在油藏开发或者开发前期,油藏环境处于十分稳定的状态,油藏中原本存在的微生物(“本源”微生物)群落并不随时间而出现很大的变化。微生物采油技术开发和应用的两个关键是:(1)了解油藏中本源微生物的群落结构;(2)通过各种工程措施来对油藏内部微生物群落进行定向调控,发挥有效微生物的采油功能,达到提高石油开采采收率的目的。对于问题(1),由于受油藏岩心样品直接采集的限制,通常用采油油井采出液来分析油藏内部微生物群落结构,但由于我国绝大多数陆上主力油田已广泛采用“三次采油”工艺(即通过向油井注入聚合物等化学物质)来提高石油采收率,油井采出液中微生物群落可能随回注水的差异而出现变化。所以只有通过了解油井采出液中不变的微生物群落来间接了解油