糖尿病大鼠下丘脑神经肽ymrna及蛋白表达的变化

糖尿病大鼠下丘脑神经肽ymrna及蛋白表达的变化

神经碱（npy）是大脑中最丰富的神经碱之一。在重要的中风状态（如弓状核、室旁核和前方内侧核）中，浓度非常高。NPY是最强的中枢食欲刺激肽之一,可产生对碳水化合物选择性的多食,长期给予NPY可导致肥胖。通过禁食和再饲试验证实室旁核NPY在调控摄食的生理行为中起着重要的作用。NPY注射到下丘脑同样的部位可刺激饮水行为。NPY注射到视上核可刺激抗利尿激素的分泌。脑室内NPY的灌注可引起胰岛素(Ins)的释放,并影响垂体激素的分泌。链脲佐菌素(STZ)所致Ins缺乏的糖尿病模型,也具有多食、多饮和垂体分泌功能的缺陷。对STZ糖尿病大鼠下丘脑NPY的研究将有助于阐明NPY在糖尿病时下丘脑垂体功能失调中的作用和在正常下丘脑调节机制中的作用。材料和方法一、糖尿病大鼠造病雌性Wistar大鼠,体重180～250克,月龄3～4个月,分为5组:正常对照组,3周和24周糖尿病组其中又分别分为Ins治疗组和非Ins治疗组。糖尿病组造病为一次性腹腔注射STZ50mg/kg,给药后72小时测血糖,血糖≥16.67mmol/L,诊断为糖尿病。Ins治疗组每天于16:00～17:00给予皮下注射长效胰岛素1～3U。大鼠自由饮水,鼠颗粒料喂养,监测血糖、饮水、进食和体重等情况。在糖尿病成模后3周和24周,分别处死,取下丘脑,10%中性福尔马林缓冲液固定,常规石蜡切片,片厚4μm。二、方法1.正常羊血清及生物素化羊抗兔石蜡切片常规脱蜡复水,0.3%过氧化氢-甲醇30分钟;PBS漂洗;0.1%胰蛋白酶37℃消化15分钟,PBS漂洗;3%正常羊血清,37℃,30分钟;NPY抗体(Sigma公司,1:800)37℃湿盒孵育150分钟,4℃22小时,PBS漂洗;生物素化羊抗兔(1:200)37℃湿盒孵育60分钟,PBS漂洗;SP复合物(1:200)37℃湿盒孵育60分钟,PBS漂洗;DAB显色。空白对照和替代对照试验,结果均为阴性。2.反义地高辛探针t7含NPY的重组质粒PCRTMⅡ(由拜耳公司胡应和博士惠赠)经E.coliDh5α扩增和检测后,于T7和SP6启动子进行正义和反义地高辛探针标记(标记药盒购于Boehringer公司)。石蜡切片脱蜡复水,进行预处理后,加入Dig-cRNA-探针进行杂交,45℃,过夜;然后用RNA酶A去除残余的RNA,加入地高辛抗体,用NBT/BCIP呈色。杂交反应对照和探针对照均为阴性。三、平均粒度及面积图像分析系统(MIAS-2000型,由四川联合大学图像测试中心提供)所测灰度分为256个等级,0级最暗,255级最亮。此灰度反应免疫活性的强弱,若免疫反应活性强,免疫反应产物(NPY)含量多,则灰度值低;反之,则灰度值高。每一动物下丘脑弓状核平面,间歇取5张切片,在4×10倍镜下于室周区在同样光强度下进行平均灰度及面积测量;在20×10倍镜下计室旁核和弓状核的阳性细胞数。四、统计处理实验数据用x¯±sx¯±s表示,并用Q检验进行各组间的统计学分析。结果一、血糖控制时间所有糖尿病大鼠均有典型的多饮、多食、血糖增高和体重减轻等特点。在Ins治疗组,多饮、多食、消瘦较未治疗组轻,但由于本实验为皮下注射长效Ins,有低血糖现象,将Ins剂量调小,故血糖控制不是十分满意,特别是3周组。24周未治疗组大多出现程度不等的白内障(5/7),而Ins治疗组未见发生。二、stz糖尿病小鼠脑弓状核平面氮和基因发现表21.nby阳性的神经在弓状核及室旁核的鉴定在鼠的下丘脑弓状核平面,弓状核区可见较密集的NPY阳性神经纤维分布,第三脑室室周区可见密集的NPY阳性神经纤维分布。在弓状核及室旁核可见NPY阳性的细胞,弓状核可见较强的mRNA转录,细胞被染成深蓝色,在室旁核未观察到NPY的mRNA转录。视上核也可见NPY阳性的细胞,其mRNA转录较弱,胞浆中可见一些蓝色颗粒,但在糖尿病组和正常对照组之间差异无显著性。2.对比周区ny阳性神经纤维面积和平均灰份STZ糖尿病鼠无论3周还是24周未治疗组室周区NPY阳性神经纤维的面积均较正常鼠明显增加(P<0.05),其中24周糖尿病鼠室周区NPY阳性神经纤维面积虽较3周组稍小,但无统计意义。Ins治疗组阳性纤维区周围界限不清,故未测量。室周区的平均灰度值3周和24周未治疗组均较对照组明显降低(P<0.05),说明糖尿病未治疗组的NPY含量增加。Ins治疗组室周区的平均灰度值较未治疗组增高(P<0.01),说明Ins治疗可使室周区NPY的含量减少(图1)。Ins治疗组与对照组、24周组与3周组之间差异无显著性。3.各组阳性细胞数的比较糖尿病未治疗组弓状核NPYmRNA及蛋白阳性细胞数较正常对照明显增高,3周组较24周组阳性细胞数显著增高(P<0.05);而治疗组弓状核阳性细胞数较未治疗组减少(P<0.05)(图2,3),且3周与24周组之间无差异。4.两组阳性细胞数目的比较室旁核NPY的阳性细胞数变化与弓状核类似,糖尿病未治疗组其NPY的阳性细胞数增多,治疗组阳性细胞数目减少(P<0.05),3周组和24周组之间的差异无统计学意义。(图1～3见插图第1-2页)糖尿病大鼠血清ny合成的调节机制在免疫组化研究中,下丘脑的室旁核及弓状核均可见NPY阳性的细胞,但用原位杂交的方式发现NPY的mRNA在弓状核细胞表达较多,说明NPY在弓状核合成然后通过轴突传递到室旁核。Brady等在食物受限和剥夺的大鼠中也证实NPY的浓度变化在室旁核,而NPY的mRNA转录水平变化在弓状核。本研究结果支持这种观点。本研究证实无论是STZ糖尿病鼠3周组还是24周组,弓状核及室旁核的NPY阳性细胞数均较对照组增加,室周及室旁核区的阳性神经纤维也明显增加,且3周组增加比24周组增加更多,这与Willims等的报道相一致。下丘脑弓状核及室旁核NPY含量的增加可能与STZ所致糖尿病鼠的多饮、多食相关。已报道将NPY注射到室旁核、室内侧核和下丘脑的外侧区,可导致多饮多食。在Ins治疗组,虽然血糖仍高于正常,但下丘脑弓状核及室旁核区的NPY含量降低,鼠的多饮、多食现象较未治疗组明显缓解,这更进一步说明NPY参与糖尿病的多饮、多食的调节。在Ins不足的糖尿病鼠中,多食是对尿中葡萄糖的丢失和由于过度的分解代谢及糖进入细胞障碍所致的体重下降的代偿。在非糖尿病鼠限食造成体重丢失20%时,发现其下丘脑,特别是室旁核NPY含量增加。无论是糖尿病还是饥饿导致的体重丧失,在下丘脑食欲调节区NPY含量的增加导致多食,均是一种恢复体重的重要调节机制。由体重丧失所致的NPY增多,具有刺激进食和增加Ins分泌所致的物质贮存的作用。这也是下丘脑腹内侧区损伤后引起肥胖的重要因素。垂体功能失调也许是下丘脑NPY活性增加的副作用,但是对反向激素(生长激素和甲状腺激素)的抑制有利于合成代谢和饥饿动物的生存。影响下丘脑NPY合成和分泌的因素尚不完全清楚,推测与以下三方面的因素有关。(1)外周Ins水平减少可直接刺激NPY的表达。中枢神经系统的Ins是外周Ins通过特殊的转运途径进入的。Ins与其在弓状核的受体特异的结合,可以改变弓状核NPY的表达而影响摄食。低Ins水平的代谢状况可以增加下丘脑NPY的合成和释放(如饥饿和1型糖尿病)。脑室内Ins灌注,降低下丘脑NPY的基因表达也更支持这一观点。(2)血糖水平的变化也可以改变下丘脑NPY的表达。有的学者认为血中Ins水平不是影响NPY变化的重要原因,其理由为有高Ins血症的Wistar肥胖鼠和低Ins血症的BB鼠及STZ糖尿病鼠都可引起下丘脑NPY的含量增高。而血糖水平更可能是引起NPY变化的原因,高血糖本身就可增加下丘脑NPY的含量,其他一些影响糖代谢的因素也可增加下丘脑NPY的含量。(3)与STZ糖尿病有关的代谢失衡也可直接或间接的影响NPY基因的表达。Wilding等用地塞米松处理大鼠可导致下丘脑NPY的含量和基因表达增高。STZ糖尿病大鼠可出现血中皮质酮增高,进而说明皮质酮也可能参与NPY基因表达的调节。本研究中Ins治疗组血糖控制虽然未达对照组水平,但下丘脑弓状核及室旁核NPY含量降低,糖尿病鼠多食多饮症状明显好转,特别是3周组大鼠血糖水平仍较高,但NPY含量下降,且多饮,多食症状亦好转,也支持低胰岛素血症而不是高血糖导致NPY含量增加,进而造成多饮多食。Williams等报道在糖尿病鼠视上核有NPY阳性的胞体,而在正常对照组则缺如。他们在以后的实验又证实视上核NPY含量在糖尿病组和对照组无差异。本研究结果证实,在糖尿病和正常对照动物的视上核均可见NPY阳性的细胞,且两者间NP