基于液质联用技术同时测定大鼠体内的六种甾体皂苷及其在药代动力学方面的研究

基于UHPLC-MS/MS技术同时测定大鼠体内的六种甾体皂苷及其药代动力学的研究汇报人：孙萌

2015.4.20关键词：甾体皂苷、UHPLC-MS/MS、大鼠血浆、药动学研究摘要：超高效液相电喷射离子化串联质谱的技术被应用于同时测定大鼠血浆中的知母皂苷

H1(TH1),知母皂苷E1(TE1),知母皂苷E（TE），知母皂苷B-Ⅱ（TB-Ⅱ），知母皂苷B-Ⅲ（TB-Ⅲ），AS-Ⅰ。血浆样品加入内标物人参皂苷Rh1（GRh1）后用乙腈沉淀蛋白。色谱柱为ACQUITYFTMBEH反相C18柱（100mm×2.1mmi.d.,1.7μm），梯度洗脱，流动相为含有0.05%甲酸和5mM甲酸铵的乙腈—水。六种甾体皂苷用三重四级杆质谱仪负离子电喷雾离子源，多反映监测模式（MRM）进行定量。监测产生的离子对分别为：TH1，TE1，TE，TB-Ⅱ，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ以及内标GRh1的m/z,1211.5＞1079.6,935.5>773.4,935.4>773.5,919.6>757.4,901.5>739.3,757.4>595.3and637.3>475.3。6种甾体皂苷方法学验证在曲线范围0.5-400ng/ml下完成。日内和日间精密度（RSD%）小于9.4%，每个分析物的平均提取回收率在82.5%-97.8%之间。6种甾体皂苷在准备和分析阶段的储存都是稳定的。大鼠灌胃BGE（丁基缩水甘油醚）知母提取液，第一次采用此方法学测定大鼠体内六种甾体皂苷的浓度，进行药动学研究。1、Introduction中药知母，知母的地下根茎，百合科，在临床上经常用于治疗伤寒，咳嗽，便血，咳血等疾病。植物化学研究表明知母中含有甾体皂苷类，山酮类，蒽醌类，苯丙酯类以及生物碱等化合物。甾体皂苷类为知母中药理活性最强的部位。TH1，TE1，TE，TB-Ⅱ，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ这6个为主要的活性成分。它们有多样的生物效应如抗血小板凝聚、抗炎、抗肿瘤、增强认知等作用。因此，对知母这六种成分全方面的药动学评价更能理解其药理和临床作用。TLC、GC、HPLC等方法已被提出来检测知母中的甾体成分。但这些方法的分析周期长或者灵敏度很低，而且也不适合口服给药后生物样品的检测。近年LC-MS技术被广泛应用于各种甾体成分的分析。在之前的研究中，HPLC-MS在选择性检测模式（SIM）下可检测血浆中的TB-Ⅱ和TA-Ⅲ。由于单四极杆质谱检测的低灵敏度和低选择性，不适合知母口服给药后多成分的药动分析。UHPLC-MS/MS一个非常强大而且可靠的用于化学成分分析的工具，而且质谱的多反映检测模式（MRM）有高灵敏度和高特异性。目前已被广泛应用于复杂多靶点生物基质的确定。运用UHPLC-MS/MS同时测定生物样品中知母的多种甾体成分还未见报道。

本文用全面的UHPLC-MS/MS方法来测定大鼠血浆中的甾体成分TH1，TE1，TE，TB-Ⅱ，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ。液相分离使用1.7μm粒径的柱子，确保其高分辨率和分离速度。在负离子电喷射离子化质谱条件下，尽量确保各个单体在分析时的高灵敏度。Fig.1为它们的结构。使用这种方法，口服给药后知母中的6种成分将被一一检测出来。2、实验2.1化学品和试剂标准品TH1，TE1，TE，TB-Ⅱ，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ和内标GRh1均从上海鼎瑞制药有限公司购得。LC-MS/MS检测其峰面积，纯度超过98%。知母的乙醇提取物由西安医院药物代谢重点实验室准备。化合物TH1，TE1，TE，TB-Ⅱ，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ干浸膏分别为3.1,7.1,2.8，46.2,2.2,和0.7mg/g。质谱级别乙腈、甲酸铵和甲酸从Fisher购得。超纯水由Mili-Q系统制得。别的试剂都是分析级别。2.2

仪器和条件色谱分析仪器为安捷伦1200系列，包括一个二进制的溶剂传送系统，在线真空除气器，自动进样器，恒温控制箱。化学成分在装备有VanGuardTM予柱（5mm×2.1mmi.d.,1.7μm）ACQUITYFTMBEH反相C18柱（100mm×2.1mmi.d.,1.7μm）上进行分离。流动相A为加有5mM的甲酸铵的0.05%甲酸水溶液，流动相B为加有5mM甲酸铵的0.05%甲酸乙腈溶液。线性梯度条件如下：0min25%B,0.5min28%B,4min30%B,4.5min100%B,7min100%B。然后化学成分保持在100%流动相B中2min。流速为0.3mL/min，进样体积5μL。柱温在测定过程过程中保持40℃。用50:50的乙腈-水冲洗注射器。质谱检测在负离子模式下由配备有电喷射离子源的安捷伦6410三重四级质谱仪执行。干燥气体温度维持在350℃，流速为10L/min，氮气压力40磅，毛细管电压-3500V。保压时间为200ms，质量分析器Q1和Q3用于单位质量分辨率。前体碎片离子对，每个分析物的最佳碰撞电压和能量如Fig.1。安捷伦MassHunterB3.0软件用于控制装置、数据采集和分析。2.3校准液、质控样品和内标的制备储备液TH1，TE1，TE，TB-Ⅱ在70:30的乙腈-水溶液中，储备液TB-Ⅲ，AS-Ⅰ和内标GRh1用甲醇溶解。各个储备液储存在-40℃中，并在3个月内稳定。标准品的储备液进一步溶解在70:30的乙腈-水中，配制系列标准工作液分别为TB-Ⅱ20,40,100,200,400,1000，2000,4000和8000ng/mL，TH1，TE1，TE，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ10,20,50,100,200,500,1000,2000和4000ng/mL。校准样品根据1:20，用空白血浆稀释标准工作液，获得终浓度范围为1.0-400ng/mL的TB-Ⅱ，以及浓度范围在0.5-200之间的TH1，TE1，TE，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ。QC样品包括3.0,30,300ng/mL的TB-Ⅱ，1.5,15,150ng/mL的TH1，TE1，TE，TB-Ⅲ，AS-Ⅰ。2.4血浆样品的准备大鼠的血浆样品从-40℃冰箱中取出，在室温下缓慢溶解。200μL的血浆中加入30ng/mL的内标工作液，再加入400μL的乙腈。涡旋2min后，于4℃下10400×g离心10min，上清液转移至另外一个EP管中，在低温（室温）下真空离心蒸发浓缩。残渣溶解在1:1的100μL乙腈-水溶液中，在4℃，10400×g离心10min后取5μL上清液进样。2.5方法学验证根据FDA指示的关于工业生物方法学验证，验证方法的特异性、线性、灵敏度、精密度、准确度、集体效应、提取回收率以及稳定性。2.5.1特异性考察方法学特异性考察六个不同批次的未给药的大鼠血浆。用先前的提取过程和LC-MS/MS条件来检测空白样品中的内源性成分是否干扰。空白生物样品的色谱图与接近定量下限模拟生物样品比较。在这个浓度下的电子信号比空白血浆样品中的响应值至少高5倍。2.5.2线性和定量下限方法学的线性考察通过分析包含9个非零浓度点的6个标准曲线。根据标准品与内标的峰面积比来绘制标准曲线，采用最小二乘法线性回归，不包括原点。标准曲线的相关系数r为0.99或更好。LLOQ在做标曲时可确定。LLOQ为最低浓度点，定量下限的准确度应在在80%-120%之间。RSD小于20%。2.5.3精密度和准确度日内准确度和精密度是在一天内测定3个浓度的QC样品5个批次。日间准确度和精密度是连续3天测定5个批次。准确度用偏差表示。精密度用RSD表示。在±15%之内可以被接受，靠近定量下限的在±20%可以被接受。2.5.4回收率和基质效应回收率和基质效应都是通过比较3个浓度的平均峰面积响应值。提取回收率是通过比较加标准品后再经预处理和预处理样品后再加入标准品。回收率应该是一致精确可重复的。基质效应是通过比较预处理后加入标准品的样品的峰面积和标准溶液的峰面积。如果加有6种甾体皂苷的血浆样品与标准溶液相差不超过15%则认为可以忽略。如果基质效应小于85%则认为离子抑制，若超过115%则认为离子增强。2.5.5稳定性分析物在大鼠血浆中的稳定性检测在不同条件下3个浓度QC样品的峰面积。短期稳定性考察室温25℃下样品保存4h后的稳定性。这一过程需超过样品的准备时间。冻融稳定性是在连续的3天内从-40℃到室温反复冻融3个循环测定其稳定性。长期稳定性是将样品储存在-40℃下30天后测定其稳定性。当浓度差异在15%范围内则可认为是稳定的。2.6药动研究雄性的SD大鼠（200±15g）从第三军医大购得。所有动物喂养在温度25±2℃，湿度60±5%的动物房中，12小时昼夜交替。适应性喂养5天后，在实验前12小时禁止食不禁水。动物随机分为4组，分为1,2,3,4组，每组10只老鼠。1,2,3组静脉取血4个点，第4组只取两个点防止脱水血量减少。所有老鼠口服给药4g/kg剂量的知母提取液（混有0.5%的羧甲基纤维素钠）。口服给药后分别在0,0.083,0.167,0.25,0.5,1,2,3,4,6,8,10,12,和24h眼眶取血250μL于加有肝素的聚丙烯离心管中。4℃，2200转离心3min，血浆样品保存在-40℃冰箱中备用。药动参数的分析采用软件3P97。药动参数如最高血药浓度（Cmax），达峰时间（Tmax）均可从药时曲线上直接获得。消除速率常数（k）用曲线上最后四个点取对数作线性回归分析。消除半衰期用下面的公式可算出：T1/2=0.693/k。从0-tmin药时曲线下面积（AUC0-t）用梯形积分法算出。AUC0-∞3.结果和讨论3.1方法的建立为了建立一个快速可靠精确的方法，优化质谱和色谱条件以减少质谱离子源的抑制和增强作用以及确保结构类似的6种甾体成分和内标能够高效分离开是至关重要的。3.1.1优化提取过程生物基质多成分的分析受他们不同的溶解度，pKas以及稳定性的影响。为了在保留时间内不受内源性物质的干扰最大限度萃取出所有的分析物，液液萃取以及蛋白沉