动物细胞体外培养知识

动物细胞体外培养基础知识2009-09-25石欣欣1基础知识要点一、动物细胞培养的基本概念二、细胞培养的基本条件三、细胞培养的基本过程四、细胞培养的设施设备及培养器皿五、细胞传代的准备工作六、细胞培养的基本操作七、细胞库八、大规模细胞培养提高表达量需要解决的问题

及实验方法九、细胞培养需要注意的问题2一、基本概念1、细胞培养：动植物细胞在体外条件下存活和生长，此时细胞不再形成组织，主要是指用来生产次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术。2、动物细胞体外培养的生长类型：贴附型和悬浮型。3、动物细胞大规模培养技术：是建立在贴壁培养法和悬浮培养法的基础上，融合了固定化培养、流式细胞术、生物反应器技术等而发展起来的。主要包括悬浮培养、微载体培养、微囊化培养、中控纤维培养等。3二、基本条件1、无菌无毒的培养环境。2、恒定适宜的培养温度。3、合适的气体环境和pH。4、充足的营养，包括多种氨基酸、维生素、辅酶、核酸、嘌呤、嘧啶、生长因子。4细胞培养基介绍天然培养基---血清无血清培养基---人工合成化合物，成分确定的培养基，例如CHO325。无蛋白培养基---不添加蛋白，但可能包含动物或植物来源的成分。化学限定培养基---不含蛋白水解物，均为已知化学结构。5三、基本过程1、从整个操作过程来说包括：（1）细胞小瓶培养---传代操作（2）细胞大规模培养---转瓶、反应器操作（3）细胞冻存和复苏---原则2、从细胞生长过程来说包括：（1）延迟期（潜伏期）---传代初期，细胞增殖缓慢。（2）指数生长期（对数生长期）---细胞快速繁殖期。（3）停滞期（平台期）---细胞数量不变，

但仍进行代谢活动，进行分泌表达。（4）衰亡期（凋亡期）---细胞自溶、死亡。6四、设施设备及培养器皿1、设施设备：无菌操作间、超净工作台、CO2培养箱、灭菌柜、离心机、显微镜、细胞计数板、冰箱、工作台、生物反应器、电脑等。2、培养器皿：培养瓶、摇瓶、滚瓶、转瓶、移液管、离心管等。3、其它常用物品：酒精灯、镊子、止血钳、纱布、脱脂棉、胶塞等。7五、细胞传代的准备工作1、无菌操作间的清洁2、超净工作台的清洁3、培养器皿的准备：洗刷包扎、灭菌4、培养基的配制、除菌过滤及无菌验证8六、细胞培养的基本操作1、细胞冻存操作冻存细胞：1*107cells/ml*1ml/管冻存液配制：（培养基：血清：DMSO=7：2：1）冻存程序：4℃、30~60min-20℃、1~2h-70℃、过夜液氮中长期保存。温度降低原则：达到4度，然后达到-20度冷冻状态，再转移到-70度，18h后，在液氮中保持。92、细胞复苏操作（1）登记要取用的细胞。（2）快速取出细胞放于准备好的37度水浴中，快速溶解。（3）将溶解的冻存管细胞离心，根据细胞特性，选择合适的离心强度。（4）酒精棉擦拭冻存管后放于超净台，将细胞沉淀用新鲜培养基重悬后置于离心管中进行离心。洗涤步骤，去除DMSO。（5）细胞用新鲜培养基传入培养瓶中。103、细胞传代操作（1）先用酒精棉擦拭需要放入超净台的物品，然后将物品放入超净台进行操作。（2）无菌取样，通常检测细胞密度、活度、葡萄糖、乳酸，根据实验优化等还需要检测其他各项生化指标。（3）根据预先实验设计的传代密度或者稀释比例来添加新鲜培养基进行传代，记录代次。（4）在进行方瓶、滚瓶等大瓶传代时，需要两名实验员密切配合操作，并由监控员协助进行物品传递等工作。因此熟练各环节的细节操作对于保证无菌来说非常重要。114、生物反应器培养细胞的基本操作流程（1）反应罐安装、调试电极、管路连接。（2）反应罐洗刷、灭菌。（3）检查灭菌管路、连接电极线。（4）通过取样口抽出罐内灭菌水。（5）将补料、收料