染色体原位杂交技术

染色体原位杂交技术

原异质混合技术（ih）是生物、组织化学和细胞生物学的结合产物。该技术属于固相分子杂交范畴,是根据核酸分子碱基互补配对的原则(A-T,A-U,G-C),将外源核酸片段(即用标记的DNA或RNA为探针,probe)与染色体上经过变性后的单链DNA片段或组织、细胞上特定的核苷酸序列,在适宜条件下互补配对,结合形成专一的核酸杂交分子。再经过相应的检测手段,将待测核酸在染色体、组织或细胞上的位置显示出来。原位杂交技术是由Gall和Parue(1969)利用标记的rDNA探针与非洲爪蟾细胞核杂交首次获得成功。随着植物染色体制备技术的改进,Rayburn(1985)最早将非放射性检测系统应用到植物染色体原位杂交。目前,该技术在染色体物理作图的建立、多倍体起源、非整倍体鉴定、杂种及染色体导入片段的鉴定、内外源基因在转录、翻译水平上的特异性研究以及系统进化和亲缘关系等研究方面均得到广泛应用。原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来的,可以分为染色体原位杂交和RNA原位杂交。染色体原位杂交(chromosomeinsituhybridization,CISH)技术是用标记的DNA或寡核苷酸等探针来确定目标基因在染色体上的位置。RNA原位杂交是标记的双链DNA或单链反义RNA探针,对组织切片或装片的不同细胞中基因表达产物mRNA(或rRNA)进行原位定位。本文主要就植物染色体原位杂交技术的发展进行回顾。1原检测授权探针是原位杂交中用于细胞内特定DNA或mRNA序列定位的一段特定核酸序列。1.1酶pcr扩增探针根据生产探针的方法,可将探针分为三类:克隆化探针、酶扩增探针和化学合成探针。克隆化探针的来源是克隆化DNA。克隆化探针又根据克隆载体分为酵母人工合成染色体探针(YAC)、P1人工合成染色体探针(PAC)、人工细菌合成染色体探针(BAC)、粘粒探针、噬菌体探针、质粒探针等。酶扩增探针来源有:用于整个基因组、单个染色体或者染色体某个区域的PCR扩增定位探针或者克隆化探针的扩增文库。此外,通过RNA聚合酶还可以获得正义和反义RNA探针。这种RNA聚合酶上带有RNA分析的T3、T7或者SP6转录因子。化学合成探针包括一些简单的寡核苷酸和特殊用途的寡核苷酸探针,如分子信标或者其他带有与合成过程中或者合成后一致的不同核苷酸类型的寡核苷酸探针。根据探针的本质,可将上述方式产生的探针分为两大类型:DNA探针和RNA探针。1.1.1根据dns检测的以下特点，dna检测可以分为以下一般类型(1)重复序列、转座子和着丝粒重复序列目前所使用的这类探针主要包括rRNA基因、端粒重复序列、亚端粒重复序列、转座子、着丝粒重复序列等等。当标记和杂交足够严谨时,这些探针在着丝点附近或异染色质区和间期染色质的浓缩区域产生杂交。(2)a克隆、rflp、rapd标记由于这类探针一般只有1~2kb。通常是某个基因的DNA克隆、RFLP或RAPD标记或是用大插入片段探针如柯斯质粒或酵母人工染色体标记。采用这类标记的原位杂交技术克服了单拷贝或低拷贝序列难以杂交和不易检测的困难。(3)dna的同源性分析植物基因组的差别主要源于它们的重复DNA序列的不同,而且高等植物基因组中都有高含量的专一重复序列。因此,可利用不同基因组DNA同源性程度的差异来识别植物杂种、异源多倍体和重组的育种品系中不同来源的染色体和染色体片段。在杂交中,标记的基因组DNA首先与其完全同源的DNA杂交,通过调节标记DNA与遮盖DNA比例,可以检测出外源染色体或外源片段,同时可以清楚地显示出易位与交换的位置。1.1.2抗侧链dna探针稳定性RNA探针主要用于RNA原位杂交技术中。由于RNA原位杂交是探针与细胞内特定的mRNA杂交,故RNA比双链DNA作为探针的敏感性更强,不需要变性,并且RNA-RNA比DNA-RNA要稳定。另外,RNA探针无论是反义和有义链都可以分别体外转录,而有义链可作为非特异性杂交的背景对照,因此,此探针在RNA原位杂交中应用最为广泛。1.2检测和标记方法1.2.1不致性标记的不致性电路该方法对于组织及染色体样本制备的要求不太高,且具有较高的灵敏度,但是对杂交信号分析困难,同时存在放射性防护等问题,制约了这一技术的发展与应用,现逐渐被非放射性标记所取代。1.2.2非放射性原位杂交Manning等(1975)最先在溶液的分子杂交中使用非放射性标记,通过细胞色素C将生物素(biotin)与RNA分子连接起来。Rudkin等(1977)通过制备抗DNA、RNA复合物的抗体检测杂交后的RNA探针,最早进行免疫荧光法结合抗体,显示RNA杂交位点。Langer等(1982)将耦联有生物素的核苷(biotin-11-dUTP)通过切口平移掺入DNA探针进行染色体原位杂交,从而开创了非放射性原位杂交时期。自20世纪80年代以来相继发展了3种非放射性标记和检测DNA探针的系统,即生物素标记检测系统、地高辛标记检测系统和荧光素标记检测系统。根据标记和检测特点的不同可将非放射性原位杂交分为直接法和间接法两种。直接标记法是指掺入到探针中的标记物在杂交后可被直接检测的方法。这种标记物大多为在激发光下能发荧光的物质,故也叫荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybrisization,简FISH)。但与间接法相比,其灵敏度相对较低。间接标记法是指掺入到探针中的标记物不能被直接观察到,必须通过耦联复合物专一地结合到杂交后的探针标记物上,通过特殊的检测方法,来显示杂交位点。这种方法最常用的标记物是生物素(biotin)和地高辛(DIG)。2杂交技术在植物研究中的应用由于植物细胞壁对作为探针的核苷酸起阻碍作用,使原位杂交技术在植物研究中的应用受到一定限制,但随着植物染色体制片技术的不断改进,该技术在植物研究中的应用愈来愈广。目前可用于原位杂交的染色体主要有以下几种类型。2.1dna的构建有丝分裂早中期和中期染色体(metaphasechromosome)容易制备,并且其着丝粒、端粒和次缢痕等形态特征容易识别,有助于染色体的鉴别和杂交信号的定向。但受中期染色体结构高度螺旋化、高度浓缩的影响,其分辨率只能达到1~3Mb的水平。对于一些基因组较小的种类,如酵母、蕃茄、水稻等,在光学显微镜下很难根据每条染色体的结构分辨出单条染色体,对构建高分辨率DNA物理图谱带来困难。因此,早中期和中期染色体原位杂交技术适合于对较大的单个DNA序列以及两个或多个相距较远的DNA序列进行物理定位。早中期和中期染色体制片一般采用去壁低渗法。2.2粗线期染色体的结构染色体减数分裂粗线期染色体(pachytenechromosome)浓缩程度比中期染色体大为降低,分辨率可达100kb左右。同时粗线期染色体在普通的光学显微镜下还具有可识别的结构特征,包括着丝粒位置,短臂和长臂的比例,异染色质和常染色质的形态等。另外,粗线期染色体所在的细胞几乎不存在细胞壁,染色体伸展良好,同源染色体配对提供了两个目标位点使目标区域增加了一倍。但粗线期染色体作为原位杂交的靶DNA的载体也有一些不足。选择时期合适的用于制备粗线期染色体的花粉母细胞较费时费力;多倍体的粗线期染色体因为有复杂的配对构型、不联会和染色体粘连等情况而使分析特别困难;大基因组的粗线期染色体很长,难以追溯和识别单个的染色体。粗线期染色体制片一般采用滴片法和压片法。2.3间期细胞核的组织结构间期细胞核的染色质比分裂时期的染色体浓缩程度低得多,其分辨率水平一般为50~100kb。间期细胞核虽然仍保持着细胞中原有的空间结构,但没有典型的染色体结构,而且在不同的细胞类型和染色体区域,染色质的凝缩模式和程度不同,因此虽可以作为定量地分析物理图谱中相邻重叠群间隙的一种工具,但必须有相应的对照标准,故其应用范围受到一定的限制。2.4色质丝的dna浓缩度通过人为地改变染色质的原有空间结构,可突破原位杂交的分辨率限制。这种染色质丝已经失去了原有的细胞空间结构,其DNA的浓缩度进一步降低。根据heng等实验统计,每微米游离染色质丝大约相当于80kb的DNA分子长度,其FISH分辨率接近10kb,可用于分析1Mb范围内DNA序列的位置关系。2.5变性剂dna纤维DNA纤维是在游离的染色质的基础上对间期细胞核更进一步处理。其基本原理是首先将单细胞悬浮液涂在载玻片上,然后用碱性变性剂将染色体的结构破坏,让DNA分子与复合的蛋白质分离而形成游离的DNA纤维。DNA纤维原位杂交具有更快速、更直接、更简便的优点,在1Mb的DNA范围内,其分辨率能达到1~2kb。但DNA纤维原位杂交也有不足之处,它不能阐明靶序列相对于着丝粒、端粒和异染色质块等染色体标记的位置和取向,如果没有已知位置的DNA标记的共定位则不能鉴别染色体。3染色原位异交的发展3.1fish的特点Pinkel等1986年首次报道了荧光原位杂交,即用荧光素标记探针以检测杂交信号的技术。这是一种通过荧光免疫反应来检测信号的非放射性原位杂交技术。FISH具有敏感快捷,能同时显示多种颜色等优点,因此能同时进行多个探针的定位以及次序确定。目前,FISH经不断的丰富和完善已衍生了一系列技术,下面主要介绍3种。3.1.1认识ish和规律探索小理论体的原位杂交将BAC克隆或YAC克隆与具有高灵敏度的FISH技术结合,即细菌人工染色体荧光原位杂交技术(BAC-FISH)或酵母人工合成染色体荧光原位杂交(YAC-FISH)。采用植物基因组的大片段克隆(即BAC克隆和YAC克隆)作探针的FISH技术克服了单拷贝或低拷贝基因难以杂交和不易检测的困难。BAC克隆的插入片段为100~200kb,YAC克隆更大,与靶DNA的杂交几率大大增加,而且杂交信号的强度和检出率显著提高。3.1.2双螺旋模型中b-dna分子的表现提高FISH的分辨率和灵敏度一直是一个重要课题。Parra和Windle(1993)、Heiskanen等(1994)、Florijn等(1995)提出的伸展DNA纤维的方法,使DNA纤维的伸展程度从最初的80kb/μm(Heng,1992)达到了现在的2.5~3.5kb/μm。这一数值与Watson-Crick建立的DNA双螺旋模型中B-DNA分子的理论值2.97kb/μm十分接近。高度伸展的植物DNA纤维使FISH的灵敏度和分辨力大大提高,分辨力达到1~2kb,灵敏度可达到<700bp。这些强大的优势使得Fiber-FISH能够直接显示DNA序列的线性位置,从而准确的构建出DNA物理图谱。还可以根据DNA纤维的伸展程度来测定DNA序列的大小和拷贝数,以及物理作图中重叠群(contig)之间的间隙(gap)大小,从而直接对DNA进行定量分析。3.1.3杂交定位技术多色荧光原位杂交是一项新发展的技术,相对于其他原位杂交技术更有助于检测多染色体区域和绘制单一细胞中相互关联的序列图谱。同时为分析染色体变异的高度自动化也提供了基础。多色荧光原位杂交(M-FISH)就是利用没颜色的荧光素标记不同探针,同时对一张制片进行杂交,从而对不同的靶DNA同时进行定位和分析,并能对不同探针在染色体上的位置进行排序。Dauwerse等利用该技术对12种DNA探针分子在染色体上的排列次序及真实物理距离进行同时检测,并取得成功。组合标记FISH(combinatorialFISH)是一个探针同时利用几种不同颜色的半抗原或荧光素进行标记,这使M-FISH的容量大大增加。若用不同比例的各种荧光素对每个探针进行标记,即比例标记FISH,M-FISH的容量将进一步增强,并能进行定量分析。3.2gish外源染色体的结构分析及分子活性判断基因组原位杂交(Genomicinsituhybridization,GISH)是20世纪80年代末,由染色体原位抑制杂交(ChromosomeinsitusuppressionCISS)衍生而来的一种重要的原位杂交技术,是一个精确、安全的研究工具,在分子细胞遗传学领域发挥着重要作用。GISH常用于分析植物基因组结构,确定外源DNA的插入位置及定量分析,鉴定外源染色体片段,分析植物杂交品种染色体成分来源以及进行近种属或品系的比较研究。通过比较研究,可以进一步为探讨物种的起源、进化和分类提供分子细胞遗传学实验证据。GISH进一步发展也衍生出一系列技术,如多色基因组原位杂交(multicolorgenomicinsituhybricization,McGISH)分析技术,即使用不同的半抗原标记不同来源的基因组总DNA,对异源多倍体和近缘物种的种间杂种或它的衍生系进行原位杂交。McGISH在确定源自属间杂交的易位染色体基因组来源方面比一般GISH的分辨能力要高得多;同时基因组原位杂交(simultaneousgenomicinsituhybridizationwithprobepreannealing,SP-GISH),即用两种不同标记的基因组DNA探针经过预退火反应,来同时原位杂交分析某个物种与近缘或远缘物种间相同和不同的重复DNA顺序在染色体上的分布特征,从而探讨植物的进化关系。3.3带后再进行原位杂交Neslson等创建了原位杂交显带技术,就是将染色体显带技术与原位杂交技术相结合,即在一个片子上显带后再进行原位杂交。这一技术既能确定特定的染色体,又能确定探针所杂交的具体位点,可以更加精确地定位目的基因,将靶序列定位到染色体的特定区段。染色体分带原位杂交技术对控制农艺性状的基因进行细胞学遗传分析,从而为克隆这些优质基因,应用于植物遗传育种,培育出更多的对人类有益的品种打下坚实的理论应用基础。3.4高渗透率roDNA原位合成技术是由Koch等(1989)建立的。此技术是利用寡聚核苷酸引物对细胞残余和浓缩染色质的高渗透性,从而提高原位杂交的效率和检测的灵敏度。基本方法是在退火温度下,将变性的染色体与末端标记的寡核苷酸引物特异结合,最初是利用探针作为引物,并在KlenowDNA聚合酶或TaqDNA聚合酶的催化下,在反应液中渗入已标记的脱氧核糖核苷酸,引物原位延伸,据此检测探针杂交的位置。其优点是简单而快速,背景干扰少。3.5原位pcr检测原位PCR技术是近年来不断完善的PCR技术与原位杂交技术的完美结合。Hasse等(1990)首次报道了原位DNA多聚酶链反应,简称原位PCR(insituPCR)。该技术集PCR的高效扩增与原位杂交的细胞定位优点于一身,能够在组织切片、细胞等样品中检测到低拷贝甚至是单拷贝的DNA和RNA,并在细胞形态学上准确定位。它是通过在单细胞或染色体水平上对特定的DNA序列进行原位PCR扩增后,根据带有标记的扩增产物来检测定位。它与PRINS技术极为类似,只是其反应信号强度经多次循环大为增加。原位PCR技术包括直接原位PCR、间接原位PCR、原位反转录PCR、原位再生式序列复制反应4种技术,可根据具体研究目的选择实验方法。3.6同型衍生物的选择性转化Johnson等1999年首次提出了第三链原位杂交技术。它是根据寡聚核苷酸链的特点,设计的一种不需要对染色体进行变性处理的原位杂交方法。其原理是,基因组中重复序列区域基因表达调控区存在的富嘌呤-富嘧啶的核苷酸双链螺旋的大沟中,在偏酸性条件下容易与第三链结合。所以,该技术不需要RNA酶和蛋白酶处理,在45℃杂交,即可达到很强的序列特异性。杂交后用长波紫外线激发进行光固定,之后的检测方法与荧光原位杂交相同。该方法不需要进行级联免疫放大就可在光学显微镜下分辨出杂交信号。目前,该技术主要应用于动物及人类研究中。Johnson等用补骨脂素和生物素修饰的16-核苷酸同型嘧啶的3条链与人类第17染色体上α-卫星的单一多拷贝序列原位杂交。随着人们对植物的三链DNA的深入研究以及探针设计方法的完善,该技术也可应用于植物的研究。4小麦染色体重排和基因重叠杂交的新技术目前,染色体原位杂交新技术在染色体识别,基因定位,基因重排,染色体易位,亲缘关系以及遗传图谱的建立方面应用较为广泛,其中以基因定位应用最为广泛。Hanson等(1995)和Gomez等(1997)利用BAC-FISH和YAC-FISH技术成功地将不同低拷贝基因的BAC克隆分别定位在棉花和高粱的染色体上。Jiang等(1995)将与抗白叶枯病基因Xa21相关的BAC克隆定位在水稻的第11染色体的长臂上,而且是单拷贝座位。Fransz等(1996)利用Fiber-FISH技术对马铃薯进行了重复序列的定位,之后,在番茄DNA上进行了端粒重复序列的染色体定位和DNA分子排列,并成功地进行了抗虫基因准确的染色体定位。Schwarzacher等用GISH在小麦中定位了外源染色体、染色体片段以及染色体结构变异等。Jiang等(1993)采用N显带-GISH(genomicinsitu