荧光原位杂交fish检测her2基因状态的研究

荧光原位杂交fish检测her2基因状态的研究

17q12-21.32的人类表皮生长因子受体2基因。对于h-2、h-neu或c-erbb-2，编码了跨膜酪氨酸激酶受体。受体蛋白质与h家族及其配体之间的相互作用，通过细胞间的信号传达调节细胞的生长、生存、分化和生长。研究表明,大约25%~30%的浸润性乳腺癌和80%乳腺导管内癌患者有HER2基因扩增或蛋白过表达,而这些患者可能预后不佳、激素治疗和常规化疗反应差,但却是曲妥珠单抗(trastuzumab或Herceptin)治疗的靶点人群。因此准确地检测HER2状态是有效治疗乳腺癌的前提。目前美国食品及药物管理局(FDA)批准用于HER2检测的方法有2种:即检测HER2蛋白的免疫组织化学(IHC)法和检测HER2基因的荧光原位杂交(FISH)法。因IHC和FISH实验方法自身的固有特点,导致IHC检测HER2表达(2+)与FISH检测HER2基因状态结果之间的一致性较差,而IHC(3+)也并非代表HER2基因扩增,IHC检测HER2蛋白表达阳性患者的预后以及对药物治疗的反应也存在着明显的差异,因此选择并使用准确可靠的检测方法非常重要。我们介绍FISH检测HER2基因状态的方法及结果判读标准,并选择HER2蛋白IHC结果分别为阴性(-),阳性(1+)、(2+)和(3+)的乳腺癌石蜡标本,以FISH方法检测其HER2基因状态,分析两种方法所得结果的一致性,探讨目前争论最多的IHC(2+)和(3+)与FISH检测结果的一致性,以期为临床选择准确有效的HER2诊断手段提供可靠的依据。分子检测方法ph1.组织标本:从北京协和医院病理科2000—2005年乳腺癌石蜡包埋组织库档案中,按抽签方式随机选择经IHC法检测过HER2蛋白表达的女性乳腺癌组织标本28例(除例4为浸润性导管癌+浸润性微乳头状癌,例22为乳腺浸润性导管癌+导管内癌外均为浸润性导管癌),IHC(3+)12例(例1~12)、(2+)10例(例13~22)、(1+)3例(例23~25),(-)3例(例26~28)。连续切4μm切片2张,1张用于HE染色,另一张未染色的切片用于FISH分析。2.IHC检测用HercepTestTM试剂盒(购自DakoCytomation公司,CodeNo.K5240),EnVision法。3.FISH检测:(1)试剂与探针:石蜡预处理Ⅱ试剂盒,其中主要含有的预处理溶液和蛋白酶缓冲液、PathVysionTMHER-2探针试剂盒、橡胶水泥均购自Vysis公司。(2)标本处理:石蜡切片于56℃烤片过夜。常规脱蜡,即将玻片置于二甲苯中3次,每次10min,100%乙醇中3次,每次10min。在预处理溶液中,80℃处理10min,再于蛋白酶溶液中消化15min,依次经70%、85%和90%的乙醇脱水后,自然干燥。(3)FISH:取10μl探针混合液滴于经过上述处理的组织标本上,盖上盖玻片,橡胶水泥封片。将标本放在杂交仪中,73℃变性5min后,37℃杂交过夜。次日取出标本,去掉橡胶水泥,在洗脱液(2×SSC/0.3%NP40)中,73℃洗涤2min,再于室温下在洗脱液中洗涤5s,自然干燥。二脒基苯基吲哚(DAPI)对比染色,在荧光显微镜下,通过特异的滤光片分别观察细胞中显示不同颜色的信号,通过VideoTest软件进行图像合成。4.结果判读标准:(1)IHC:按照Dako公司提供的分级进行结果判读。即全部瘤细胞中细胞膜均无染色或<10%瘤细胞膜染色者结果为0;瘤细胞>10%细胞膜不完整弱染色者结果为(1+);瘤细胞>10%细胞膜轻度至中度完整染色者结果为(2+);瘤细胞>10%细胞膜完整强染色者结果为(3+)。(2)FISH:首先在HE染色切片上确认癌细胞区域,然后在10倍物镜下,于FISH标本上找到HE的同一视野,再仔细观察信号。其过程为:在40倍物镜下扫描整张标本,观察是否存在HER2表达的异质性以及标本的质量。满意的标本应是75%以上癌细胞核中都有杂交信号,然后于100倍物镜下,通过特异的单通道滤光片观察癌细胞核的FISH结果并进行信号计数和cut-off值计算。PathVysionTM的探针试剂盒中混合了2种DNA探针,一是标记为绿色荧光的17号染色体着丝粒,另一是标记为橙红色荧光的HER2基因,而细胞由DAPI染成了蓝色。在观察癌细胞并进行信号计数时,应选择细胞核大小一致、核的边界完整、DAPI染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色着丝粒信号清晰,并且一般为2个或以上信号点的细胞,随机计数20~30个癌细胞核中的双色信号,红色信号的总数与绿色信号的总数比值≥2时,即为HER2基因扩增,否则为无扩增;若两种信号的比值>20或众多信号连接成簇时,可不用计算,即视为基因扩增;若比值介于1.8~2.2之间(临界值),则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个分析者重新计数。若遇到HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时,要于另一癌区域再计算20~30个癌细胞核中的红绿信号值,报告其最大值,并加以注释。在观察信号时,应根据情况随时调节显微镜的焦距,准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏,并注意避免G2期细胞内的基因拷贝数目特征(4个拷贝)可能导致的计数误差。着丝粒绿色信号数本研究中IHC检测HER2表达(3+)12例标本(例1~12),经FISH检测HER2基因的结果为10例扩增,且其中2例为多体(例10和11),即17号染色体着丝粒绿色信号数>2,另外2例无扩增的病例均为多体(例6和8),仅例2为单体;IHC(2+)10例(例13~22)标本中,经FISH检测HER2基因的结果为7例(例13~18、20)扩增,其中1例(例17)为多体,另3例无扩增病例中1例(例19)为多体;IHC(1+)3例(例23~25)标本均无扩增,其中1例(例25)为多体;IHC(-)3例标本均无基因扩增,其中1例(例28)为多体(图1~6)。例4浸润性导管癌+浸润性微乳头状癌扩增,例22乳腺浸润性导管癌+导管内癌无扩增。主要的现代检测方法对于ihc和fish的检测结果是很难成功地治疗乳腺癌主要依赖于早期诊断和适当的治疗。相关研究表明,对于早期患者来说,与传统的肿瘤分级相比,明确其激素受体状态和HER2扩增或过表达状态等个体特异性生物学信息,对于预后和治疗更为重要。而适当的治疗方案的选择取决于生物学标记的准确检测及其结果的正确判读。HER2基因产物是正常表达于分泌腺上皮细胞的跨膜生长因子受体,参与调节细胞生长和发育的过程。正常细胞中HER2基因为2个拷贝,HER2基因扩增,将导致转录上调、增加蛋白合成,驱动带有该异常分子改变的肿瘤细胞大量增殖。自1987年Slamon第一次描述了乳腺癌中HER2及其生物学意义以来,大量的研究表明,HER2活性与乳腺癌不良预后密切相关,并且HER2过表达与淋巴结阳性、癌的高级别、阴性激素受体状态及高增殖活性有关。但也有不同的看法,例如,Reed等认为HER2蛋白表达与预后和生存期无关,Berry等的研究结果显示,HER2状态并非影响抗激素治疗的效果等。基于这些争论,研究者们采用IHC和FISH两种方法分别检测HER2蛋白质和基因状态并比较了两者与乳腺癌相关临床特征之间的一致性。他们发现,IHC(3+)与FISH检测结果的一致性较好,而IHC(2+)与FISH检测结果的一致性较差;HER2状态检测结果为FISH阳性而IHC(-)患者的生存期较FISH和IHC均为阴性的患者生存期短。为了排除药物的干扰,Schmidt等针对未经任何治疗的淋巴结阴性乳腺癌患者HER2状态的研究显示,HER2基因扩增比HER2蛋白表达对于预后的意义更加明确,因而,他们认为只有HER2基因扩增才是一个独立的预后因子;对于IHC(2+)而FISH检测HER2基因扩增的患者,采用Herceptin(特异性封闭HER2蛋白的人源化单克隆抗体)治疗收到了良好的效果。这些研究结果提示,由于HER2检测方法及结果判读标准等方面的差异导致了研究数据的不一致,FISH检测结果比IHC更可靠、更值得信赖。IHC技术因其具有简便、廉价、快速等特点,而成为目前病理学实验室检测HER2状态的首选方法。但由于IHC本身的固有特点,例如标本固定和处理过程中蛋白容易受到破坏,抗原修复时,提高了灵敏度而减低了特异性,不同批号抗体之间的差异,以及结果评分的主观判读等,都将影响IHC的准确性。尤其是标本固定不当对于Ki-67和p27的结果影响较小,而对激素受体和HER2的影响较大。尽管严格的实验室质控可帮助提高诊断的准确率,但由癌组织染色体非整倍体(aneuploid)等遗传学特征性改变导致的IHC假阳性问题仍是无法避免的。与蛋白质相比,DNA的稳定性则好得多,实验操作过程中受到的影响较小,特别是FISH有别于IHC的主要特点之一是结果的定量判读,尽量避免了主观上的误差。目前实验室选用最多的PathVysionTM探针试剂盒中同时包含了17号染色体着丝粒探针,校正了非整倍体造成的实验误差。与其他分子生物学检测手段相比,FISH既可以在组织和细胞结构相对完整的前提下,于癌细胞原位分析单细胞核内基因的变化,又同时排除了其他非癌细胞的干扰,因此被公认为是目前HER2基因状态检测的金标准。与其他实验技术一样,FISH结果也会受到一些因素的影响,如标本长时间固定、烤片温度过高、蛋白消化不当等,都会造成信号减弱或无信号;固定液的使用也非常重要,欲做FISH的标本应选用4%中性甲醛固定,经乙醇等其他固定液处理的标本实验效果不佳;操作者和结果分析者的经验也直接影响实验的成功和结果的准确性。Roche等曾经比较了普通实验室和FISH中心实验室的HER2检测结果,两者存在着一定的差异。目前用于临床诊断的探针采用了双色直接荧光标记系统,与间接标记方法相比,其实验设计更严密,操作更简便稳定,结果准确率更高,但成本相对较高;与IHC相比,FISH的实验设备也较为昂贵(表1)。染色体的非整倍体是癌细胞普遍存在的遗传学特征之一,Watters等的研究显示大约50%左右的浸润性乳腺癌患者癌细胞的17号染色体为非整倍体,这种遗传学改变可能与不良预后有关。按照我们在本文中采用的FISH结果判读标准,有的17号染色体多体(polysomy)伴有HER2基因扩增,而有的则无扩增。Risio等发现17号染色体单体(monosomy)伴HER2基因扩增的患者可能对Herceptin治疗的反应较差。Hammock等认为,对于IHC(3+)但HER2基因无扩增的患者来说,约50%以上是17号染色体多体所致,而HIC(2+)与多体无明显相关。Mrozkowiak等的实验结果显示,IHC(2+)的标本经FISH检测无HER2基因扩增的为80%。我们通过FISH方法共检测了27例浸润性乳腺癌,其中17号染色体多体8例,低于Watters等的研究结果;本研究中共分析了12例乳腺癌Her2表达IHC(3+)的患者,其中2个经FISH检测无扩增,但都是17号染色体多体,而在扩增的10例中,有1例是17号染色体单体;我们采用的ICH试剂盒与Mrozkowiak等所用的相同,所分析的10例IHC(2+)标本中,经FISH检测无基因扩增的有3例,其中1例是多体,与Mrozkowiak等的数据差别较大;全部IHC(1+)的3例标本均无基因扩增,其中1例为多体。所以多体可能是IHC(3+)假阳性的主要原因,在那些基因无扩增的IHC(1+)和(2+)的标本中也有多体现象存在。若要进一步了解IHC(1+)、(2+)而HER2无扩增是否与非整倍体的改变有关,IHC(3+)和(-)与HER2基因状态的一致性,以及非整倍体与预后或治疗反应之间的相关性,都依赖于更多研究数据的积累。人们已越来越多地了解了HER2在乳腺癌发生、发展、预后及治疗中意义,同时也不断地探索着其他相关检测技术(显色原位杂交、逆转录聚合酶链反应、ELISA等)用于HER2临床诊断的可行性。近来,Meng等从24个原始肿瘤组织中蛋白表达和基因扩增均为阴性患者的外周血中分离出循环中的肿瘤细胞(circulatingtumorcells,CTCs),通过FISH方法证实,其中9人发生了HER2基因扩增,这一结果使HER2扩增机制及其与疾病进展的关系,原发肿瘤和转移瘤中HER2状态的一致性,以及病情进展中HER2变化的监测和治疗方案的合理调整等问题也成为人们关注的焦点。近来,采用一种新近开发的FISH信号自动扫描系统,可实现自动图像分析和信号计数,提高了分析效率,同时也在一定程度上推动