荧光原位杂交fish的研究进展

荧光原位杂交fish的研究进展

原子能分子杂交技术是目前最广泛应用的分子之一。我们可以识别原子间的异质性。该技术是分子克隆技术的重要组成部分。DNA荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术是在核酸分子杂交基础上发展起来的一门技术，是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在核中或染色体上显示DNA序列位置的方法。该项技术自20世纪70年代后期问世以来已经在很多领域有广泛的应用。目前，荧光原位杂交技术已广泛应用在细胞遗传学、育种学、医学等多个领域，如动植物基因组结构、变异及空间规律的研究、分辨复杂的染色体易位变异、病毒感染、DNA物理图谱的构建、人类的产前诊断、哺乳动物染色体进化研究、转基因的细胞学鉴定、检测外源染色体片段及其渗入特点、物种间的亲缘关系、性别鉴定及RNA的表达。它与放射性同位素技术相比具有快速、安全、灵敏度高、探针可长期保存等特点，不但能显示中期分裂核,还能显示于间期核，同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术。随着分子生物学的发展,新探针的出现特别是全探针及染色体原位抑制杂交技术的出现,计算机辅助的共聚焦显微系统和数字成像系统的发展,FISH技术的应用会加深加快人类的肿瘤学、产前诊断、哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域的研究。1原聚光灯技术1.1dna序列测定荧光原位杂交技术的基本原理是将DNA探针用特殊修饰的核苷酸分子标记，然后将标记的探针直接原位杂交到染色体或DNA纤维切片上，再用与荧光素分子藕联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维上的定位、定性、相对定量分析。具体过程包括以下几步:（1）固定标本；（2）预处理样品；（3）用相应的探针进行杂交；（4）洗掉未结合的探针；（5）封固、呈像及结果分析。1.2非放射性标记fps荧光原位杂交探针的类型十分广泛,大小可以从几Mb到几百bp。探针的获得可通过克隆、酶扩增及化学方法合成，多种探针的使用使得FISH技术成为一个多功能原位研究DNA和RNA结构和功能的方法。过去的探针均采用放射性物质———同位素来进行标记，其灵敏度虽然较高，但是实验周期长、背影深、分析复杂、放射性探针不稳定、污染环境、对人体健康不利等。荧光（非放射性）原位杂交正是弥补了以上的缺点，与放射性标记相比，非放射性标记具有以下优点:(1)用荧光试剂标记探针经济、安全，同时在特异性、速度、探针稳定性方面具有明显的优势；(2)多色FISH可以在同一核中显示不同颜色，从而可检测多种序列；(3)应用不同的探针可以显示某一物种全部基因、某一染色体或染色体片段；(4)能通过几次免疫化学反应，杂交信号增强显著，从而提高灵敏度；(5)杂交信号定位更加准确，分辨率可达3～20Mb。1.2.1检测类型1.2.2荧光素抑制剂标记检测探针的荧光素标记分为间接标记和直接标记：间接标记是用生物素标记的dUTP(biotin-dUTP通过缺口平移法来标记，杂交后再用联有荧光素的抗生物素抗体检测。通过几轮处理，可将检测信号放大，监测到小至500bp的靶序列，FISH的敏感性可通过酶促信号放大而提高。直接标记是通过荧光素直接与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价结合、或缺口平移法标记探针时掺入荧光素核苷三磷酸标记探针。探针经过简单冲洗就可镜检，省去了间接标记的探针杂交后繁琐的检测步骤，但不能将信号放大，不如间接标记的探针灵敏，其靶较大时还是比较可靠，且探针标记种数不受高亲合力配基能力限制。2原聚光刻技术的应用2.1在染色体结构和功能的研究中的应用1.1FISH在基因定位中的应用：FISH可以直接测定DNA序列在染色体上的定位情况，基因的染色体定位是FISH在分子生物学上应用的重要方面。如FISH与生化、计算机和重组DNA技术结合检测Alu位点，表明DNA序列与带型有关；FISH还为当前着丝粒结构研究提供了重要的研究手段，主要是对着丝粒重复序列的分析，包括重复元件，如α、β和传统卫星DNA的性质和分布；FISH可以直接观察染色体端粒，简化了对其在核内的结构和功能研究，定位其端粒序列。2.1.2在染色体结构研究中的应用：理论上认为中期染色体中姐妹染色单体形成的螺旋手性相反。有研究应用FISH确定几个单拷贝DNA序列的位置，因为所用小探针的荧光信号可以被认为在染色单体的内侧，中间和外侧的不同部位，结果发现它们在姐妹染色单体之间位置是对称的，而且这种非随机位置在染色体从前中期到中期的不同阶段均保持不变，证实了FISH技术能够检测到中期染色体的高度有序结构。FISH直接观察SC结构中的染色质可以阐明减数分裂染色体的高度有序结构，有助于了解减数分裂染色体配对和重组的机制。而荧光原位杂交技术用人染色体特异探针能有效地检测出人类和灵长类动物染色体畸变，有研究还表明荧光原位杂交技术与G显带技术相结合研究同一标本能迅速准确地描绘出染色体结构畸变的类型和细节。2.2微生物生态学的应用FISH技术具有很多优点，如快速、准确、原位等,因而目前在微生物生态学各个领域研究中已成为了强有力的工具。2.2.1fish的应用目前，环境中存在的微生物品种和数量远远超过已鉴定的微生物，FISH技术可以将整体微生物环境清晰的呈像出来而不需要额外的抽提和扩增等易引起偏差的步骤，所以,FISH技术被广泛应用于环境微生物多样性的研究。SimonNathalie等在2002年利用FISH技术研究海水中细菌和有害藻类种群之间的相互作用；ArayaRuben等在2003年对溪流中和水中生物膜上的微生物群落进行了FISH研究。2.2.2群在此工艺中的作用Ardern和Lockett在1914年发明了活性污泥法处理污水，但是直到今天微生物种群在此工艺中的作用还没有完全了解清楚。基于rRNA的FISH技术开始使人们逐渐摸清了微生物的作用机理，CoskunerG,CurtisTP于2002年用FISH技术原位鉴定了活性污泥中硝化细菌群落的组成和分布,为理解污水处理中氮素循环提供了重要的信息。2.2.3原位杂交，致突变大部分的内共生微生物是难于培养的，利用16SrRNA技术,它们可以被鉴定和系统分类，但在原生动物和真核细胞生物中有很多摄食泡或肠内的微生物不易和真正的内共生微生物区分，利用FISH技术的原位杂交原理可以对它们进行鉴别。PeraudO,YousafM,HamanaMT等于2002年对海绵体中微生物种群进行的分析,发现产生抗疟疾化合物ManzamineA的海绵可能仅仅只是真正产生此化合物微生物的宿主。2.2.4基因组织的研究有研究证明,FISH技术是分析正常的微生物群落和混合细菌感染的强有力的工具，利用FISH技术检测到在人类口腔中有300余种不同的细菌,其中大多数是很难培养或根本不能培养的品种。如BrinigMaryM等2003年通过FISH技术研究了难于培养的TM-7细菌在人类口腔中的分布和传染机理。2003年FosterJamieS等通过FISH技术以人类口腔细菌群落为模型研究了基因对基因相互作用。肠胃是微生物在人体最大的定居和活动场所,所以研究正常健康的肠胃菌群和其形成的生物膜是非常重要的，而用常规的培养方法会低估微生物的数量和种类。SwidsinskAlexander;LadhoffAxel等于2002年利用FISH技术研究了肠炎患者的肠粘膜菌群，发现随着病人疾病程度的加重，其肠粘膜上的菌群密度也增大。2002年Ben-AmorKaouther等利用FISH技术对人类粪便中难于培养的卵胃球菌样细菌(Ruminococcusobeumlikebacteria)进行了鉴定和计数,发现此类细菌是人类粪便中极其重要的组成部分。社区获得性肺炎是近年来开始流行的严重的呼吸系统疾病。BuccatA等于2002年利用FISH技术对能够引起社区获得性肺炎的病原体进行了快速鉴定。军团菌病也是一种较严重的呼吸系统流行病，2002年BuchbinderSusanne等利用FISH技术在水样中的鉴定了军团菌(Legionellaspp.)。3fish法检测微生物群落特征FISH技术从发展至今，经历了一系列的发展,逐渐形成了快速、精确、原位以及可动态观察等特点，目前荧光原位杂交技术已越来越广泛的应用在细胞遗传学、育种学、医学等多个领域,尤其在检测遗传物质的突变和染色体上基因定位等方面显示了极大的优势。随着分子生物学的发展，新探针的不断出现特别是全探针及染色体原位抑制杂交技术的出现，计算机辅助的共焦显微系统和数字成像系统的发展，FISH技术的应用会加深加快人类在肿瘤学、产前诊断、哺乳动物的染色体进化研究及亲缘关系等领域的认识。近几年来,FISH技术逐渐向生态学领域尤其是微生物生态学领域渗透利用此技术已经在微生物生态学研究中取得了一系列重大成果。但是,任何技术都有不足之处,FISH技术也不例外，样品自身产生的荧光,以及探针的特异性都会影响试验的结果。所以在进行研究时结合传统的培养、镜检等方法及现代分子生物学的多种方法,得到的结果将更加可信，而随着技术的不断进步,FISH的准确性和灵敏度将进一步提高,必将在微生物生态学研究领域得到更加充分的应用。常用的探针可分3类:(1)染色体特异重复序列探针(probetochromosome-specificrepeatedsequence)。像α卫星、卫星Ⅲ类的探针,他们的杂交靶位常大于1Mb,不含散在重复序列,与靶位结合紧密,杂交信号强,易于检测,常用于监测间期细胞非整倍体和微小标志染色体;(2)特异性位置探针(specific-locusprobe)。常有一个或几个克隆序列组成,可由cDNA克隆或克隆到大片段插入载体的核酸片段制取,主要用来进行染色体克隆DNA序列定位和检测靶DNA序列拷贝数及结构变化;(3)全染色体或染色体区域特异性探针(wholechromosomeorchromosomeregionspecificprobes)。由一条染色体或其上某一区域的极端不同核酸片段组成,可由克隆到噬菌体(phage)和粘质粒(cosmids)上的染色体特异性大片段插入文库制取,且微切文库探针片段小,与邻近区域发生重叠及制片过程中被破坏的可能性小。这类探针可用于中期染色体重组和间期核结构分析。FISH技术不仅提供静止的实验结果,还可以动态地观察流动水体中的微生物种群变化,可以检测季节更替对高山湖泊中微生物群落的影响,并且利用FISH技术得到了一