实验5 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血红蛋白-20151102

实验八聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血红蛋白1一、目的要求1.学习电泳原理和技术2.学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离鉴定蛋白质技术2电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。电泳条件：水溶液（缓冲液）、支持物（区带电泳）、电场（电泳仪、电泳槽）电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳等。区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移，分离成一个个独立的区带。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。二、定义与分类3聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N

，N

—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。4丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶特点：在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；化学性能稳定，对pH和温度变化较稳定；无吸附和电渗作用，样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。5根据介质是否均一，可分为连续电泳和不连续电泳移动方向：带电性质决定。蛋白质、酶、激素、核酸及其衍生物等物质都具有许多可解离的酸性和碱性基团，它们在溶液中会解离而带电。一般说来，在碱性溶液中（即溶液的pH值大于等电点pI），分子带负电荷，在电场中向正极移动。而在酸性溶液中，分子带正电荷，在电场中向负极移动。不同的质点在同一电场中泳动速度不同，常用泳动度（或迁移率）来表示。

泳动度：带电颗粒在单位电场强度下的移动速度。三、原理67影响泳动度的因素：

1颗粒本身：主要取决于带电质点的性质，即颗粒所带净电荷的量、质点的大小和质点的形状。一般来说，质点所带净电荷越多，质点直径越小，越接近于球形，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。

2外界因素：电场强度E、pH、离子强度I、电渗、缓冲液粘度及温度等。A：电泳前3层凝胶排列顺序，3层胶中均有快离子，慢离子

B：电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。

C：蛋白质样品分离成数个区带。电泳过程示意图——不连续电泳加样加电场，样品浓缩在界面上电泳结束浓缩胶分离胶8胶浓度不同；pH值不同不连续凝胶电泳的分离原理：1、电荷效应

各种蛋白质所带电荷不同，有效迁移率也不同。2、样品的浓缩效应

在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris-Glycine，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris-HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris-HCl，pH8.9)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同（浓缩胶孔径大）。在这种条件下，缓冲系统中的HCl几乎全部解离成Cl－，两槽中的Glycine(pI＝6.0)只有很少部分解离成Glycine的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。Cl－速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Glycine负离子最慢(尾随离子)。由于Cl－很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Glycine离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。不连续凝胶电泳的分离原理：3、分子筛效应

蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH升高(pH8.9)，使Glycine解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Glycine的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的电荷、大小和构型移动。分离胶的孔径有一定的大小，网孔径大小不同。分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，引起泳动速度的变化，从而达到分离目的。

(a)凝胶孔径不连续性(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性(c)电位梯度的不连续性凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。表3.4分子量范围与凝胶浓度的关系分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)

蛋白质

10420-30 1-4×10415-20

1-5×104-1×10510-15 1×105 5-10

5×105 2-5

核酸(RNA)

104 15–20 104–105 5-10 105-2×106 2-2.6 11SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只与蛋白的分子量有关。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS）。三、试剂与器材试剂：凝胶贮液（30％ACr-0.8%Bis)10%过硫酸铵TEMED分离胶缓冲液（3.0MpH8.9Tris－HCl缓冲液）浓缩胶缓冲液（0.5MpH6.8Tris－HCl缓冲液）pH8.3Tris-Gly电极缓冲液考马斯亮蓝R250染色液

考马斯亮蓝脱色液

上样缓冲液：取浓缩胶缓冲液6.25ml、蔗糖10g、SDS2.3g.、1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。

器材：双垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪PAGE电泳装置14四、操作方法1.制备胶板前的准备将玻璃板洗干净、干燥。注意不要用手摸玻璃板内侧；玻璃板与胶垫接触的地方不能有缝隙，以防漏胶。5个组（10个人）制两块胶15

2.配胶

12%分离胶(10ml)

5%浓缩胶(5ml)试剂名称所需试剂用量/ml所需试剂用量/ml

水3.83.4凝胶贮液 4.00.83分离胶缓冲液(pH8.8Tris-HCl)2.5—浓缩胶缓冲液(pH6.7Tris-HCl) —

0.6310％SDS0.10.0510%过硫酸铵 0.10.05

混合后

TEMED 0.0040.005凝胶配制过程要迅速，一定要混匀后灌胶，注胶一次性完成，避免产生气泡.分离胶母液6ml浓缩胶母液3ml+凝胶剂TEMED8ml在分离胶凝固成胶以后（约20-30分钟），再配浓缩胶溶液