医学检验中应用的核酸检测技术

医学检验中应用的核酸检测技术

现在，人类疾病与疾病直接或间接关系。原子能成像和分析在遗传疾病、肿瘤和传染性疾病等领域的应用越来越广泛。这为疾病的诊断和治疗提供了新思路，并与疾病有关的疾病的发病机制有关。医学实验室所要检测和分析的核酸既包括人体本身的基因(DNA)以及反映基因转录水平的mRNA,也包括侵入人体的致病微生物等所携带的外源性基因(DNA或RNA)。现介绍医学检验中应用的核酸检测技术及其进展。一、样品的制备1.细胞匀浆和dna纯化常用材料多为人白细胞或组织细胞,前者取EDTA-Na2抗凝全血用NH4Cl或双蒸水作低渗溶血处理,洗涤后即可得,因肝素会抑制限制性内切酶和DNA多聚酶的活性,故血液抗凝剂一般不用肝素,组织细胞则须先用匀浆器在冰浴中研磨成细胞匀浆。上述经预处理的细胞经十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K作用消化分解蛋白质,继用一定比例的酚、氯仿、异戊醇抽提液将蛋白质除去,所得的DNA溶液用乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化,现已有多种商品化的DNA分离试剂盒供应。DNA纯度和含量的测定用比色法,在紫外分光光度计上测定A230nm、A260nm和A280nm值,DNA(双链)含量为A280nm值×50μg/ml×比色时的稀释倍数,A260nm/A280nm比值>1.7示纯度较高,A260nm/A280nm比值>2.0表明含酚等杂质少。2.rna的提取RNA的检测、序列分析、cDNA文库的构建以及蛋白质的体外翻译等均要求RNA保持完整性并达到一定的纯度。由于RNA酶(RNase)广泛存在(如汗液、气雾及受检细胞内)且十分稳定不易失活,内源性和外源性的RNA酶是影响RNA完整性的最大威胁,因此,所有用于RNA提取的工作面、器械、容器、溶液和及用于预电泳的电泳槽等必须经特殊的物理或化学处理,以去除RNA酶的污染;为避免细胞组织在保存过程中RNA的自身降解,取样应新鲜,短期贮存可置-70℃,长期则须置液氮速冻;在RNA提取过程中应规范操作,抑制RNA酶的活性和严格防止污染,常用的RNA酶抑制剂有焦碳酸二乙酯(DEPC)、异硫氰酸胍和RNasin,近年来有商品化的RNaseZAP(一种能去除各种容器表面RNA酶污染的喷雾型制剂)和RNaseSecure(用于去除溶液RNA酶污染的制剂)供应,使处理过程大为简化。RNA的提取以往多用异硫氰酸胍法,现国外已推出TRIzol提取试剂盒,简便快捷且得率高。mRNA是基因转录的产物,在研究基因表达水平时常要求得到较纯的mRNA,利用成熟的mRNA3’端均含有多聚腺嘌呤核苷酸(Poly-A)的特点,可将RNA上寡聚脱氧胸苷酸(Oligo-dT)纤维素柱,在不同的盐浓度下mRNA与该柱的结合能力不同,mRNA藉高盐条件特异性地结合于柱上,继降低盐浓度使mRNA被洗脱下来,一般经2次过柱可得到较高纯度的mRNA。二、核酸探针aa的制备方法与标记物该技术是建立最早、最基本核酸检测技术,核酸分子杂交是指具有一定互补序列的核酸(RNA或DNA)单链在液相或固相体系中按碱基配对原则缔合成异质双链的过程,应用该技术可对特定DNA或RNA分子进行定性或定量的检测。该技术的关键工具是探针,即人工制备的与待测核酸分子互补、标有不同标记物的单链DNA或RNA。核酸探针按其来源不同可分为通过克隆技术从基因文库中筛选的基因组探针、从RNA逆转录获得的cDNA探针和人工合成的寡核苷酸探针。标记物最早采用放射性核素,后有生物素、地高辛、荧光素,近年来又发展出N-醋酸-2-乙酰氨基(AFF)修饰的探针和磺化半抗原探针等,可按需要和条件选用。核酸分子杂交反应受离子强度、pH值、温度、时间、探针种类、大小及浓度的影响,需根据各自的条件摸索确定。核酸分子杂交常用的方法有以下几种。1.待检核酸片段的国中身份鉴别利用硝酸纤维膜具有吸附单链DNA和RNA的特性,可将DNA样品直接点在纤维素膜上,或用带狭槽的装置将待检RNA点成狭线,经变性、固定后先经鲑精DNA预杂交,以降低背景和非特异性信号,再加探针杂交,最后根据探针的标记物不同,用放射自显影、链霉亲和素酶结合物或抗地高辛抗体酶结合物显色等判断待检核酸片段中是否存在与探针同源的序列,方法简便易行,可作定性或半定量分析。2.实验4标记物互补结合显色法将特异性探针包被在微孔板上,与待检物互补结合,继加可与待检物结合的标记物,经显色后判断靶序列存在与否(见本文三、PCR-杂交酶联技术)。3.dna片段转移经限制性内切酶酶解的DNA片段经电泳分离后按相对分子质量大小排列在琼脂糖凝胶上,由于凝胶的机械强度不高,在杂交过程中易断裂,胶内的DNA片段也会随着时间的推移逐渐扩散丢失,为解决这一问题,Southern利用高盐溶液的上吸作用,将变性后的片段按原区带位置转移到硝酸纤维膜上,继经预杂交、杂交显示结果。吸印转移的方法还有电转移和真空转移等。4.利用甲醛/琼脂糖凝胶变性电泳分离用于RNA的检测分析,单链RNA先用甲醛/琼脂糖凝胶变性电泳分离,继按相同的原理将其转移到硝酸纤维膜上,再进行杂交、预杂交显示结果。5.原位杂交和调整用标记的DNA或RNA为探针,在组织或细胞原位进行核酸分子杂交以显示组织细胞内某一部位特定的核酸片段,其优点是可以对特定核酸片段进行组织细胞的定位。用于原位杂交的玻片需经去除核酸酶、包被粘附剂等预处理,以防止细胞内RNA的降解及细胞脱落,国外已有专供原位杂交用的商品化玻片供应。原位杂交分直接法和间接法两类,前者是将各种标记物标记在探针上,如荧光原位杂交技术(FluorescenceinSituHybrization,FISH)已有不少商品化的试剂问世,但直接标记的探针经过杂交,标记物稳定性有所下降;后者则是用半抗原标记探针,继通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接显示探针与靶核酸形成的杂交体,后者的稳定性和通用性较强。三、标准和制度不完善1985年问世的PCR,是模拟DNA体内复制过程、将目的基因在体外扩增的技术,其特异性和灵敏度俱佳,我国于80年代末引进并用于临床,当时多以PCR产物电泳后特定碱基对(bp)条带的有无作为定性结果的判断依据,在产物的分析方法、实验室设置、防污染操作规范、人员培训和试剂质量等方面无统一的标准,管理制度亦欠完善。为使PCR技术的优势得到充分体现,有必要按国际惯例结合国情建立一整套管理制度,包括按标准建立专用实验室,对操作人员进行正规培训,严格遵循操作规范,实行全过程质控,试剂中引入防污染系统,扩增产物的分析采用杂交、限制性片段长度多态性等取代可能影响结果准确性的电泳法,试剂须经国家药品生物制品检定所(SDA)检定合格方可用于临床等。1.反应混合物配制和扩增区临床PCR实验室应设独立相隔的四区:(1)试剂贮存和准备区;(2)标本准备区;(3)反应混合物配制和扩增区;(4)扩增产物分析区。如采用扩增和产物检测同时完成的荧光定量PCR或全自动分析仪则可将(3)、(4)两区合并。上述各区应分别按该区的标准配置专用的仪器、工具和各种用品。临床PCR实验室应经主管部门验收认可。2.pcr扩增植酸盐的处理PCR实验的污染主要来自经成百万倍扩增的产物,同时也不可小视来自天然基因组、试剂以及标本间气溶胶扩散导致的污染。扩增的产物污染引致的PCR假阳性可用UNG/dUTP系统有效去除,具体过程为:扩增底物中以脱氧尿嘧啶三磷酸核苷酸(dUTP)取代脱氧胸腺嘧啶三磷酸核苷酸(dTTP),故产物中含尿嘧啶核苷(dU),后续扩增之前,在PCR体系中加入能分解dU的尿嘧啶糖苷酶(UNG),在预变性加热时,若体系中存在前一次扩增产物的污染,污染物中所有的dU处均被UNG酶解断裂,不可能作为下一次扩增的模板,从而达到消除污染的目的。此外,长波紫外线的持续照射,通过异补骨脂素光化学产生DNA加合物也有可靠的效果。其他的去污染措施如次氯酸钠清洁工作面、实验工具和消耗品如加样器、反应管、吸样头的高压处理也必不可少。现有带滤芯的加样器塑料头问世,可预防加样器污染。3.混和液pcr这是PCR试验成功的前提和基础,如工作人员进入各工作区必须严格按1区→4区的方向,不得逆行;各区的工作服、工作鞋、消耗品、办公用品、剩余的试剂不允许移至他区使用,一次性的塑料用品用后须浸入专门的消毒液中;加样、打开装有反应混和液或扩增产物的反应管均应在通风柜中进行,并特别小心,及时闭盖,尤其是巢式PCR;若有溶液溅出必须及时记录;用微孔板杂交时应使用洗板机洗板等。4.pcr扩增过程及酶催化酶系统质控必须对核酸分析的各步骤进行质量控制,以避免假阳性和假阴性,在实验材料的准备、PCR实验的每一步骤以及扩增反应前后的酶反应各步均应有质控。所有开展临床基因扩增检测的实验室都应参加室间质量评价,并作为开展该项检测的条件和依据之一。5.经国家药物管理局sda批准，用于临床核电厂检测的认可(1)pcr-杂交酶联定量方法将PCR与杂交、酶联技术结合,反应在微孔板上进行。现国内应用的主要有3类,第1类是将与靶片段一段互补的DNA片段固定在微孔板上作为捕获探针,加入PCR产物后再加入酶标记的与PCR产物另一段互补的探针,经底物显色判断结果,称为“夹心杂交”;第2类是将生物素标记PCR2条引物的5’端,经PCR后,产物均结合有生物素,微孔板上包被有捕获探针,将PCR产物与捕获探针结合,继加能与生物素特异牢固结合的、标有过氧化物酶的链霉亲和素,最后加底物显色判断结果,本法引入内对照系统后可进行定量测定,即设计引物序列与模板相同但探针序列与模板不同的核酸片段作为内对照,将已知拷贝量的内对照与待检样品在同一反应管内扩增,对PCR效率进行校正,依据内对照分子扩增前后的比值与待检样品中靶分子扩增前后比值相等的原理,可推知受检样品中特定DNA片段的起始拷贝量,PCR-杂交酶联定量方法现已用于临床检测病毒载量;第3类反向杂交梳法,其原理是按酶标微孔板的孔间距大小制成由吸水材料和硝酸纤维膜(NC)两层组成的杂交梳,硝酸纤维膜上点有与靶序列互补的探针,在引物之一的5’端标上生物素,将待检物按PCR常规扩增的产物变性后加入微孔中,插入杂交梳,靶片段藉毛细作用与NC上的探针结合,杂交梳逐孔与链霉亲和素-酶结合物、底物作用,据探针部位是否显色判断定性结果。检测乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、结核分枝杆菌(TB)和沙眼衣原体(CT)等病原微生物的PCR-酶联国产试剂已获SDA批准用于临床。本法对仪器设备的要求不高,易普及。(2)荧光光谱分析和定量pcr1995年由美国PE公司发明的FQ-PCR技术,是在普通的PCR系统中,加入一个与靶片段序列互补的双荧光标记探针,该探针的5’端标记荧光报告基团,3’端标记荧光淬灭基团,当探针完整时,由于淬灭基团的作用,报告基团不能产生荧光,当有靶片段存在时,标记探针与之结合,在PCR过程中,当引物延伸至标记探针结合部位时,由于DNA聚合酶具有5’-3’的核酸外切酶活性,遂将探针5’端的荧光报告基团切下,同时实现链替换,由于报告基团脱离了探针,淬灭基团对其的淬灭作用解除,报告基团即可发出荧光信号,其强弱随PCR扩增进程不断加强,并与PCR产物的数量成正比,经特定的荧光光谱分析仪测得荧光强度,可实时动态定量观察PCR扩增的对数期、线性期和平台期的变化,与标准阳性定量梯度样品的标准曲线比较,可推算出待检物的起始拷贝量。FQ-PCR不仅可以准确定量,而且由于线性范围宽(0~1011拷贝/ml),样品无需稀释;仪器测定荧光信号的灵敏度大大高于肉眼对电泳条带的观察;在FQ-PCR反应中有荧光探针参与杂交,以荧光强度报告结果,因而无需对PCR产物进行电泳、杂交等后处理,除加样时一次开管外,全过程闭管操作,FQ-PCR这一最大优点,能有效克服扩增产物污染造成的假阳性,特异性相应提高。FQ-PCR适用于各种病原体的定性和定量检测,其中病毒载量定量测定已用于疗效考核、治疗方案制定和预后评估等,此外,在遗传病的突变检测、癌基因和抑癌基因结构或表达异常的检测、与疾病相关的各种蛋白(如各种受体、细胞因子、肿瘤标志物、酶、激素)的基因表达水平(mRNA)的定量检测等领域,FQ-PCR均显示了其广阔的应用前景。FQ-PCR检测HBV、HCV、CT、TB试剂已经SDA批准作为临床检验用试剂。6.基于pcr的模拟技术按分析扩增产物所采用的方法或引物设计原则不同,常规PCR衍生出多种方法,在核酸的研究和临床检测中应用日渐增多,以下作简要介绍。(1)自动化分析的启动从Sanger创立的双脱氧核苷酸链终止法起,随着方法和标记物的改变,测序已进入自动化分析的阶段。测序是研究未知基因最直接的方法,对设备和技术要求较高;(2)基因序列测定限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶,人群中个体间基因的核苷酸序列存在差异,称为DNA多态性,它可使特定限制酶切片段的大小和数目发生变化,称为RFLP,可藉此发现点突变,分析不同的基因型,用RFLP作为遗传标记,可判断遗传病先证者亲属和胎儿是否带有该病的致病基因。(3)提高染料荧光强度采用可与双链DNA特异性结合的染料SYBR-GreenI,随着PCR过程中产物双链DNA的量呈指数式增加,该染料的荧光强度亦成比例增强,可借助仪器动态监测PCR产物的量。(4)设计知识产权引物常用于分析不同的基因型,在设计PCR引物时,选取序列相同区域的DNA片段为公共引物,可在该引物的3’端引入一故意错配的碱基,另设计针对不同等位基因特定序列的若干特异性寡核苷酸引物,当携带某一等位基因的模板DNA与相应的等位基因特异性寡核苷酸引物及公共引物反应时,扩增出相应的基因片段,由此确定不同的等位基因。(5)双链突变电泳单链DNA具有序列特异性的二级结构,相同长度的单链DNA因序列的差异甚至单个碱基的改变都可影响二级结构(空间构象),可用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴别,检测双链突变可先将双链DNA变性再进行电泳,依据野生型(正常)DNA和待检样品间电泳时迁移能力的差异造成的泳动变位判断是否存在碱基的差异。SSCP广泛用于突变筛选。(6)pcr-等位基因特异性遗酚酸aso的检测分析对等位基因结构异常已知的疾病,将PCR产物与针对特定等位基因的寡核苷酸探针杂交,可确诊受检者是否带有致病基因及杂合状态。(7)pcr序列独特的阔果酸sr的检测分析对基因突变位点已知的异常,可扩增含突变位点的DNA片段,继用序列不同的寡核苷酸探针与产物杂交,根据杂交结果判断受检基因的序列。(8)突变位点引物筛选设计一条正链引物(S)和分别针对正常和突变位点的负链引物1、2,待检物分别用两对引物(S、1和S、2)扩增,据扩增产物的有无判断是否存在突变以及杂合状态。(9)基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的dna用于比较mRNA表达的相对差异,先将总RNA逆转录为cDNA,继用一套随机引物扩增该cDNA,产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后,根据泳道上显示的相同长度(可从150bp~2kb)的片段的强度不同判断转录产物的差异。(10)仪器两端的连接PCR产物在毛细管电泳仪上分析,该仪器的两极由一根内径为20~200μm的毛细管连接,适宜在高电场下运行,速度快,分辨率高,重复性好。(11)r-高效液体层析成像hplc用高效液相对PCR产物作鉴定,结果准确。但本法和PCR-毛细管电泳法对仪器和操作要求较高,均不适于临床检测。(12)低温退火条件下dnapcr检测引物设计无需特异的核苷酸序列信息,而是以1条单一的、由10个左右碱基组成的随机核苷酸序列的DNA片段为引物,在低温退火条件下对样品基因组DNA进行PCR扩增,该引物在一个或多个位点与基因组DNA结合,可使未知区域扩增获得广泛的DNA多态信息。常用以制备探针、构建基因文库和基因图谱分析,在分析微生物菌株间的亲缘关系和生物系统发生研究中应用较多。(13)微卫星dna的重复单位数目的不稳定性以及与其他疾病的基微卫星是指在人基因组中以1~6bp为单位、重复出现10~60次的DNA序列,由于微卫星区域在人基因组中出现的数目和频率不同而表现出多态性,当这种多态性序列与某一致病基因位点连锁时,可将其作为遗传标记,进行遗传缺陷的产前诊断、杂合子的鉴定及亲子鉴定等,因其具有杂合性高、高度多态、突变率低的特点,比以往所用的遗传标记应用价值更大,微卫星DNA重复单位数目的不稳定性与一些遗传性疾病相关,在一些肿瘤中发现微卫星DNA重复单位数目改变和从2bp至大片段的缺失和扩增。检测方法是对特定区域DNA作PCR扩增,藉产物的高分辨电泳来鉴别和分析。四、dna芯片的临床应用前景和局限性DNA芯片是将预先设计好的几百乃至数十万个寡核苷酸或cDNA(已知基因或带有可能突变位点的序列)有序而密集(点间距离一般<500μm)地排列在玻璃片(珠)、硅片、尼龙膜、塑料片(珠)等固相支持物上制成的微矩阵(microarray),在检测时以此作为探针,将待测样品用同位素或荧光标记后与芯片上的探针进行杂交,通过放射自显影或激光共聚焦显微镜扫描后,用计算机软件对杂交结果进行分析,获得杂交信号的强度和分布模式图,根据杂交信号所在位置探针的序列特点、衰变速率和信号强弱,获取样品分子的数量和序列信息。应用这一技术可对基因数量、序列和表达功能进行大规模、高通量、快速高效的研究,较传统的核酸印迹杂交操作简便、自动化程度高,为人类后基因组计划提供了理想的研究手段,并设计了适合临床检验的菜单式芯片系统,使每张芯片可检测多份样品。现国内已有适用于临床检验DNA芯片机和配套试剂问世,在肿瘤相关基因点突变、缺失、插入、融合的研究、遗传性疾病、单核苷酸多态性的分析、病原体及其变异的检测中取得了初步的结果。但如特异性和敏感性有待提高,样品制备和标记过程的简化、仪器的研制和机械化自动化程度的提高,降低成本等。若能解决这些问题,DNA芯片的临床应用前景将十分广阔。附件:近年来核酸分析和扩增技术颇快进展,现选摘如下,供有兴趣的读者参阅。1.核酸酶保护分析(RNaseprotectionassay)将单链DNA探针与待检RNA杂交,由于核酸酶S1专一降解单链核酸,故杂交后形成双链的部分可受保护不被降解,未形成双链的DNA或RNA单链则被S1酶降解成核苷酸,通过变性聚丙烯酰胺电泳分离,放射自显影和光密度扫描可检测RNA的长度和含量。2.转录介导的扩增(TranscriptionMediatedAmplifi