常用标记技术(上课用)20100929

常用标记技术标记技术的种类—按标记物分酶学标记荧光标记同位素标记基因标记BrdU标记荧光染料标记免疫磁珠MTT比色法标记技术的种类—按标记方法分免疫标记技术分子标记技术一、免疫标记技术定义：是将抗原与抗体用可以微量检测的标记物（如荧光素、酶、放射性同位素等）进行标记，在与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的标记物，是目前应用最广泛的免疫学检测技术。通过标记物的放大作用，提高了免疫技术的敏感性。

免疫标记技术放射物标记技术酶标记技术

免疫荧光技术

其他标记技术酶联免疫吸附技术

酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法间接法双抗原夹心法双位一点法一、免疫标记技术常用的免疫标记物质类别标记物用途荧光素FITC、RB200、TRITC免疫组化镧系元素螯合物免疫分析测定放射性核素3H、14C、32P、57Gr免疫分析测定

125I、131I酶HRP、AP免疫组化免疫分析测定化学发光物Luminol、lucigenin免疫分析测定金属颗粒胶体金、铁蛋白免疫组化免疫分析测定

Ag+AbEAgAbE+底物

呈色反应（1）酶免疫技术酶免疫分析法（EIA）是指用酶标记的抗体进行的抗原抗体反应。它将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，通过酶作用于底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng/ml甚至pg/ml水平。常用方法：酶联免疫吸附试验、酶免疫组合法常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。EIA固相聚苯乙烯Ag或Ab吸附到固相上的过程,称为包被

(酶免疫测定法)酶免疫技术的基本特点：①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；②酶促反应的专一性，保证了特异性；③底物反应的放大作用，提高了敏感性；④酶标试剂保存稳定；⑤操作简便，安全易行。常用酶及其底物1.辣根过氧化物酶(HRP)常用底物：(1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌性,但水溶性差。2.碱性磷酸酶(AP)常用底物对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价高，故应用不如HRP普及。酶联免疫吸附试验（ELISA）：是指将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分分开。分类：双抗体夹心法、间接法、BAS-ELISA。分类双抗体夹心法（SandwichELISA)：将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原间接法（IndirectELISA）：将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗检测液相中未知抗体竞争法（CompetitiveELISA)：将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体ELISA(双抗体夹心法)

检测HBsAg原理示意YY测抗原ELISA-间接法—测未知抗体竞争法—抗原、抗体测定管对照管BAS-ELISA:以生物素-亲和素-过氧化物酶复合物作为指示剂，组成一种新的生物放大系统，进一步提高检测的敏感度。一个亲和素分子可以结合四个生物素分子，结合非常稳定。亲和素和生物素可以与酶、抗体、荧光素等分子结合，而不影响后者的生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素分子，通过生物素又可连接多个亲和素。因此大大提高检测的敏感度。酶标仪酶标仪（2）免疫荧光技术免疫荧光技术是免疫标记技术中发展最早的一种，是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。常用的荧光色素：异硫氰酸荧光素（FITC）—黄绿色荧光藻红蛋白（PE）—红色荧光1.直接荧光法优点：简单、特异缺点：检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，敏感性低于间接法。（2）免疫荧光技术—将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。2.间接法优点：敏感性高、只需制备一种荧光素标记抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原。3.放射免疫技术(radiommunoassay,RIA)是指将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。假设受检标本中不含抗原时的反应条件为：4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*）在标本中存在抗原时，举例如下：4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）胶体金颗粒的基础金核并非是理想的圆球核，较小的胶体金颗粒基本是圆球形的，较大的胶体金颗粒（一般指大于30nm以上的）多呈椭圆形。在电子显微镜下可观察胶体金的颗粒形态。金免疫测定技术是指对体液中抗原、抗体含量定量测定的技术，包括斑点金免疫渗滤试验和免疫层析试验。4.金免疫技术斑点金免疫渗滤试验：是指将抗原或抗体点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水材料上，依次在膜上滴加标本、免疫金及洗涤液等试剂并与硝纤膜上的相应抗体或抗原发生反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红色斑点。金免疫层析试验：技术要点斑点金免疫渗滤试验：金免疫层析试验：是指用胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。将各种反应试剂分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条的一端，通过毛细血管作用，使样品溶液在层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成的复合物被富集或固定在层析条上的特定区域（检测线），通过标记免疫技术显色。1.双抗体夹心法免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原2.竞争法免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图3．间接法为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法(图22-4)。测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶，然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡，A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色线条。无棕红色线条出现则表明血清