人参皂苷rg3对sk-mes-1细胞裸鼠移植瘤生长及vegf、bf-gf表达的影响

人参皂苷rg3对sk-mes-1细胞裸鼠移植瘤生长及vegf、bf-gf表达的影响

rg3是日本学者在20世纪80年代首次提出的中药单体。日本学者北川洋弘于20世纪80年代首次提出了这一问题。之后，日本、中国、韩国、德国和其他国家的科学家进行了不同程度的研究。近年来的研究表明其具有抑制多种肿瘤细胞,如黑色素瘤、肺癌、胃癌及前列腺癌等的增殖、浸润、转移等作用,而且具有抑制肿瘤新生血管形成的作用,其作用机制可能为降低肿瘤细胞VEGF及其受体的表达。本实验通过建立人肺鳞癌裸鼠移植瘤模型,观察人参皂苷Rg3对移植瘤生长的影响,并从蛋白和基因水平来探讨Rg3对肺鳞癌裸鼠移植瘤的作用机制。1材料和方法1.1细胞、皂苷rg34～6周龄BALB/c裸鼠购自中国科学院上海实验动物中心,共32只,雌雄各半,体重约18～22g。人肺鳞癌SK-MES-1细胞由河南省医学科学研究所提供。人参皂苷Rg3由吉林亚泰天然药物研究所馈赠,纯度为99.5%。小鼠抗人VEGF单抗、小鼠抗人bFGF单抗购自美国SantaCruz公司,PV-9000试剂盒购自北京中杉金桥公司,人VEGF、bFGF原位杂交试剂盒购自武汉博士德公司。1.2方法1.2.1养液中常用药物人肺鳞癌SK-MES-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640细胞培养液中培养,其内加入青霉素(100kU/L)及链霉素(100kU/L),置于5%CO2、饱和湿度、37℃的培养箱内。在对数生长期用PBS制备成单细胞悬液,调整活细胞浓度为1×108/mL接种裸鼠。1.2.2观察动物一般状况及肿瘤生长抑制率ir裸鼠32只,无菌条件下每只裸鼠右侧背部皮下接种上述单细胞悬液0.1mL。第7天平均肿瘤体积约150mm3时,将荷瘤裸鼠随机分4组(8只/组)。A组(对照组):0.5mL生理盐水灌胃;B、C、D组(Rg3实验组):0.5mL浓度分别为0.5mg·kg-1、1mg·kg-1、2mg·kg-1的人参皂苷Rg3灌胃,每天1次,共28次。观察实验动物的一般状况包括精神状况、皮肤光泽、活动度、饮食、饮水情况、粪便等并称量体重;每隔3～4天测量肿瘤的长径和短径,根据公式计算肿瘤体积(V)和肿瘤生长抑制率(IR):V=ab2/2(a为长径,b为短径),IR=(V0-Vn)/V0×100%(V0代表非治疗组的肿瘤体积,Vn为治疗组的肿瘤体积),绘制肿瘤生长曲线。第35天脱颈处死动物,迅速取出完整肿瘤组织,电子天平称量瘤重,计算药物的肿瘤生长抑制率。1.2.3免疫组织化学法检测vegf和bfgf蛋白表达瘤组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,连续切片(4μm),分别行VEGF和bFGF免疫组化,两抗体的工作浓度均为1∶100,染色均采用PV-9000法,按试剂盒说明逐步操作,以PBS代替一抗作阴性对照。VEGF、bFGF蛋白定位于移植瘤细胞胞浆内,阳性细胞的胞浆呈棕黄色,胞核呈淡蓝色。高倍镜下随机选取5个视野(每个视野观察细胞数不少于200个),按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定。(1)按切片中细胞着色深浅评分:0分,细胞无显色;1分,浅黄色;2分,棕黄色;3分,棕褐色。(2)按阳性细胞数占同类细胞数的百分比评分,<30%为1分,30%～70%为2分,>70%为3分。取(1),(2)两项评分的乘积作为总积分,0～1分为阴性,≥4分为阳性。1.2.4原位杂交的结果判定瘤组织固定、包埋、切片后,收集于APES处理过的载玻片上,按照原位杂交试剂盒要求进行预杂交和杂交,杂交后显色采用BCIP/NBT底物液,以核固红复染。杂交过程中加不含标记探针的原位杂交液作为阴性对照。阳性杂交信号为胞浆内蓝紫色颗粒。原位杂交的结果判定方法为:阳性细胞数≤10%、≤30%、≤70%和>70%分别记1、2、3、4分。阳性着色强度可分为弱阳性(细胞浆内可见浅紫蓝色颗粒,明显高于背景底色)、阳性(细胞浆内见较深紫蓝色颗粒)、强阳性(细胞浆内有大量深紫蓝色颗粒)三级分别记1、2、3分。上述两种记分相乘,<1分者为阴性,≥3分者为阳性。1.3均数的方差齐性检验所有数据采用SPSS13.0统计软件处理。计量资料用(x¯±s)(x¯±s)表示。选择单因素方差分析进行方差齐性检验,多组均数间两两比较采用Student-Newman-Keuls法。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1切片he染色32只裸鼠接种肿瘤成功率为100%,实验过程中各组裸鼠未发生意外死亡。瘤体早期为椭圆形,表面光滑,后期为不规则形,表面呈结节状,部分有溃烂。瘤组织切片HE染色,光镜观察病理学特征示:瘤组织呈实体样,癌细胞核大、浓染、核仁突出,可见核分裂像。与实验前相比,各组裸鼠的进食、活动等无明显变化,A组裸鼠平均体重较其他组略轻,可能与肿瘤负荷较大,消耗增多有关。2.2两组肿瘤生长、瘤体体积、重量比较由肿瘤生长曲线可看出,A组移植瘤随生长时间延长呈递增性增长,实验结束时平均肿瘤体积是用药前的4.34倍,而B、C、D组肿瘤生长较A组明显减慢,且Rg3剂量越大,生长抑制越显著,具有剂量依赖性。实验结束时,B、C、D组瘤体体积分别是用药前的2.54、1.68和0.86倍(见图1);各组取出瘤体的重量也显著小于A组(P<0.05),有统计学意义。根据公式计算各实验组的肿瘤生长抑制率,各实验组抑制率达到41.47%、61.29%、80.14%,见表1。2.3rg3单次给药对vegf、bfgf蛋白表达的影响免疫组化显示VEGF、bFGF定位于肿瘤细胞的胞浆中,呈棕黄色颗粒。Rg3能够抑制肺鳞癌细胞内VEGF、bFGF蛋白表达,药物剂量越大,VEGF、bFGF蛋白表达越弱,具有明显的药物剂量依赖性。见图2～5,表2。2.4vegf、bfgfmrna表达原位杂交结果提示VEGF、bFGF、mRNA定位于移植瘤细胞的胞浆中,呈蓝紫色颗粒。随药物剂量增加,VEGF、bFGFmRNA表达逐渐降低,具有剂量依赖性,各实验组与对照组比较,P<0.05,有统计学意义。见图6～9,表2。3保幼健康治疗vegf的机制人参皂苷Rg3是存在于中药人参中的四环三萜皂苷,其结构为C42H72O13。近年国内外研究证实,Rg3通过抗增殖、促进凋亡等多种途径对肿瘤细胞发挥抑制作用,然而其确切的抗肿瘤机制仍然有待进一步阐明。已有研究表明,人参皂苷Rg3对高转移性的小鼠黑色素瘤细胞(B16FE17)肺转移及BALB/c小鼠结肠癌细胞(26-M3.1)肺转移具有抑制作用。WangCZ等以蒸气将西洋参加热后,发现其提取液中的7种人参皂苷含量降低,而5种人参皂苷含量增高,其中包括Rb1、Rd、Re、Rg2和Rg3。检测西洋参提取液对SW-480、HT-29、NSCLC3种肿瘤细胞系的抑制作用,同时将未加热西洋参提取液作为对照,发现Rg3增高时,西洋参提取物的抗肿瘤细胞增殖活性显著增强。KimHS等研究发现在其实验选取的11种人参皂苷中,Rg3和Rh2在体外能够抑制前列腺癌细胞系LNCaP和PC3细胞的增殖,同时发现,Rg3对于前列腺癌细胞的抑制作用可能与有丝分裂原激活蛋白激酶有关。李肖等通过对大鼠肝癌细胞的研究证实,Rg3能明显抑制肿瘤细胞增殖,有效诱导肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤组织坏死,并有剂量依赖性。本研究通过人肺鳞癌SK-MES-1细胞裸鼠皮下移植瘤实验发现,Rg3在一定范围内以剂量依赖的方式减慢移植瘤生长速度,其中Rg32mg·kg-1·d-1组用药5天就已使平均肿瘤体积小于用药前。实验结束时该剂量组有一只裸鼠的瘤体甚至肉眼完全消失,计算抑瘤率同样显示Rg3的抗移植瘤疗效非常显著。目前研究认为肿瘤细胞和血管组成一个高度整合的生态系统,源于肿瘤细胞或相关炎性细胞的弥散信号促使内皮细胞从休止状态变为快速增殖状态,并设想通过抑制肿瘤血管新生来控制肿瘤。随着内皮细胞培养技术的建立,血管生成抑制剂的发现以及血管生成活性蛋白纯化工作的完成,这一观点已为越来越多的研究证实。现代观点认为肿瘤的生长和转移依赖于肿瘤血管形成。肿瘤的生长有两个明显不同的阶段,即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期,血管的生长使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期。新生血管形成之后,肿瘤灶局部快速播散,增强肿瘤灶的远处转移能力。因此,血管形成在肿瘤的发生、发展、侵袭及转移中发挥着重要作用,已成为肿瘤治疗的新靶点之一。正常情况下,VEGF在人体许多正常组织中表达水平极低,而大多数恶性肿瘤存在VEGF高表达。Seo等报道在142份胰腺癌组织标本中VEGF蛋白阳性率为93%。血管生成另一重要的正性调控因子是bFGF。人bFGF是由146个氨基酸组成的多功能调节性多肽,分子质量为18kDa,基因编码定位于4号染色体,是分布体内最广泛的生长因子之一许多肿瘤表达此因子,具有促进有丝分裂原产生、促进趋化性和内皮细胞迁移、刺激内皮细胞产生胶原酶以降解基底膜、诱导大量来自中胚层和神经外胚层的细胞增殖和分化等作用。研究发现,许多肿瘤中均有不同程度的bFGF的表达,并与很多实体瘤的血管密度、侵袭转移及预后不良相关。TrojanL等报道在56份前列腺癌组织标本中bFGF蛋白阳性率为86.9%。本研究提示人参皂苷Rg3能够显著下调人肺鳞癌转移瘤组织中VEGF、bFGF的表达,且具有剂量依赖