鲜无睑壁虎抗肿瘤活性成分脂质体的制备

鲜无睑壁虎抗肿瘤活性成分脂质体的制备

壁虎也被称为天顺。通常用于丸、散、膏等药物。对各种疾病、骨髓炎、骨髓炎、脊髓炎、宫腔炎等均有准确疗效。壁虎散是中国潍坊地区民间治疗恶性肿瘤的验方,对肺癌、胃癌、结肠癌等常见肿瘤疗效确切,无骨髓抑制和重要脏器损害等严重的毒副作用。研究发现壁虎散的抗癌作用主要来自壁虎,壁虎散方使用鸡蛋推测是有效成分形成药物脂质体,有利于抗癌成分到达靶部位,提高生物利用度。本实验研制鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体,采用葡聚糖凝胶柱将载药脂质体与游离药物分离,建立紫外分光光度法测定脂质体中药物含量及包封率的测定方法。以包封率为主要评价指标,考察包封率的影响因素,研制鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分纳米脂质体,作者在国内外相关资料中均未见报道。仪器、试药与仪器RE52A型真空旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);DL180A型超声波清洗器(上海仕博生物技术有限公司);透析袋(截留相对分子质量10000,Ф16mm);KSI型康氏振荡器(上海仕博生物技术有限公司);FA2004型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司):825B型磁力加热搅拌器(南通科学仪器厂);SPD10AVP紫外检测器(日本岛津公司);pH计(WS型袖珍数显pH计,福建福安福光电子有限公司);WX型混合纤维素酯微孔滤膜(上海市新亚净化器件厂);BI90激光散射仪(BrookhavenInstrumentsCorporation)。鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分生物碱(潍坊医学院化学教学研究室,得率4%,W/W)。卵磷脂(PC,北京华清美恒天然产物技术有限公司);胆固醇(CH,上海海曲化工有限公司);SephadexG-50(上海树脂厂);TritonX-100(北京化学试剂厂);其他试剂为分析纯。方法1处方前的研究1.1最大吸收pbs取一定量鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分于量瓶中,用pH5.67的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解并定容,用紫外分光光度计于190～400nm波长范围内进行扫描,扫描结果可见药物在220nm处有最大吸收,选用220nm为测定波长。1.2药物浓度测定精密称取鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分25mg于50mL量瓶中,用pH5.67的PBS溶解并稀释到刻度,摇匀后精密量取适量,并用PBS稀释配成12.5,25,50,100,200,300,400μg·mL-1的系列标准溶液,以空白脂质体的PBS溶液为空白校正,采用紫外分光光度法,于最大波长220nm下测定吸收度A,以吸收度A对药物浓度进行线性回归。1.3鲜无治疗壁虎在不同溶媒中的溶解度的测定取过量的鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分于10mL的磨口试管中,分别加入5mLpH5.67的PBS溶液、乙醚、生理氯化钠溶液(NS),密塞,放入(20±0.5)℃的恒温摇床中振荡8h,饱和液放置1h,精密吸取上清液,定量稀释,UV法测定浓度,计算鲜无蹼壁虎在不同溶媒中的溶解度。2采用精密度和回收率试验测定2.1测定准确度和精密度取低、中、高3种浓度的标准对照液,在上述的测定条件下测定吸收度,1d测定5次,计算日内精密度;每日测定1次,连续测定5d,计算日间精密度。2.2回收率试验取低、中、高3种浓度的标准对照液各1份,分别按照样品测定项下的方法测定。2.3回收率的测定取空白脂质体混悬液适量,按照处方比例加入鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分,加入2mL10%的TritonX-100溶液破坏后,用蒸馏水定容,用UV法测定药物浓度,以测定的浓度和配制的浓度之比计算回收率。3采用葡萄糖凝胶层析法测定了包封率3.1葡聚糖凝胶色谱柱的制备取经pH5.67的PBS溶胀12h的葡聚糖凝胶(SephadexG-50),湿法装于1cm×25cm的玻璃色谱柱中,制得葡聚糖凝胶色谱柱。3.2tri能力的测定取制备好的药物脂质体混悬液1mL进样,用pH5.67的PBS洗脱,流速控制在0.5～0.7mL·min-1,以每份2mL接取11份,分别加入1mL的10%TritonX-100溶液破坏后,用水稀释至5mL,摇匀于220nm测定吸收度,制备洗脱曲线,见图1。3.3游离药物的稀释精密量取鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体混悬液1mL,上预先处理好的凝胶柱SephadexG-50,用pH5.67的PBS以0.5～0.7mL·min-1速度洗脱,将含药脂质体与游离药物分离后,将游离药物用蒸馏水稀释至50mL;另取1mL脂质体混悬液置50mL的量瓶中,加入2mL10%的TritonX-100的溶液破坏后,用蒸馏水稀释至刻度,分别进样,测定其含量,按《中华人民共和国药典》2005年版的脂质体包封率计算公式来计算药物脂质体的包封率:包封率/%=(A0-A1)/A0×100。其中,A0为系统中总的药物吸收度;A1为未包封的药物吸收度。4新鲜无芒醇提取物的制备方法4.1澄清和干燥溶剂(I)将卵磷脂、胆固醇置于梨形瓶中,用二氯甲烷溶解,37℃恒温水浴中减压蒸干溶剂,旋转真空蒸发使烧瓶内壁上形成均匀磷脂薄膜,真空干燥。将药物溶于PBS中,加入烧瓶中恒温电磁搅拌,水化一定时间后,静置放冷形成均匀分散的脂质体混悬液,测定其包封率。4.2水性混悬液的制备将磷脂等膜材溶于二氯甲烷中,加入含有药物的磷酸缓冲液短时超声,形成稳定的W/O型乳剂,减压蒸发除去溶剂,达胶态后,滴加PBS,旋转帮助瓶壁上的凝胶脱落,减压下蒸发,制得水性混悬液。4.3扩大直接蒸除系统为膜的装置称取2g卵磷脂、1g胆固醇,加入20mL二氯甲烷,置于250mL磨口梨形烧瓶中,在30℃恒温水浴中,用旋转蒸发仪在转速140r·min-1及减压的条件下蒸除有机溶剂,使磷脂等成膜材料在烧瓶壁形成均匀类脂薄膜,向烧瓶中充N210min,使溶剂完全除去;向烧瓶中加入PBS20mL,将0.2g鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分溶入其中待其完全溶解后加入上述类脂薄膜中,同温下用旋转蒸发仪转动洗膜使脂质膜全部从瓶壁上转移入水相,磁力搅拌15min,使充分溶胀水合,待形成的类脂薄膜水合变成牛奶状脂质体混悬液,再将该脂质体混悬液超声分散10min,30℃水浴下,溶液由乳白色转为半透明,康氏振荡器振摇,得鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体。5影响包封率的因素5.1药物使用比对密封率的影响采用旋转薄膜-超声法,分别制备药脂比为1∶5,1∶10,1∶15和1∶20的鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分纳米脂质体,并测定包封率。5.2鲜无治疗壁虎抗肿瘤活性成分脂质体的制备固定药物量、油水两相比例和其他条件不变的条件下,按磷脂/胆固醇(W/W)为2.0∶1,2.5∶1,3.0∶1,4.0∶1时制备鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体,测定包封率。5.3有机溶剂对密封率的影响制备脂质体所采用的有机溶剂一般为乙醚、氯仿、二氯甲烷等,本实验考察了不同溶媒对包封率的影响。5.4超声时间和超声强度对密封率的影响制备脂质体的关键是形成乳剂,超声时间和超声强度是重要的影响因素。考察超声时间和超声强度对包封率影响。6新鲜脂肪积聚分析6.1粒度和粒度分布取鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分纳米脂质体适量,生理氯化钠溶液稀释后,用激光散射仪测定脂质体的粒径粒度分布。6.2脂质体分散取少量药物脂质体制剂滴至载玻片上,3%磷钨酸进行负染,滴至专用铜网上自然挥干,使粒子在铜网上浓缩沉积,用透射电子显微镜观察并摄照片。6.3热压灭菌对脂质体的影响将脂质体混悬液灌封于安瓿中,于115℃,30min热压灭菌,观察脂质的变化。6.4辐射污染对脂质体的影响将脂质体混悬液灌封于安瓿中,60Co辐射灭菌,观察脂质体灭菌前后的色泽、形态、粒径,包封率变化。6.5储存条件对脂质体的影响将制备的脂质体分别于室温(25℃)、冷藏条件(4℃)下放置4个月,观察脂质体外观形态,分散性及其包封率变化。结果1鲜无治疗壁虎抗肿瘤活性成分测定结果浓度为12.5,25,50,100,200,300,400μg·mL-1时的吸收度分别为0.076,0.119,0.249,0.464,0.861,1.286,1.694。结果表明鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分浓度在12.5～400μg·mL-1范围内,以吸收度A对药物浓度进行线性回归,吸收度与浓度呈良好线性关系,回归方程为:A=0.0042C+0.0301,r=0.9997(n=7)。标准曲线见图2。结果溶剂为pH5.67磷酸盐缓冲液(PBS)、乙醚、NS时,表观溶解度分别为198.4,805.5,145mg·mL-1。由结果可知鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分的脂溶性较强,比较适宜做成脂质体。2脂质体的药物载药量测定结果见表1～3,由表2可见,此法的方法回收率符合要求,由表3可见,药物的加样回收率良好,不干扰药物的含量测定。载药量(drugloading,DL)是指微粒制剂中所含药物的重量百分率,载药量是评价脂质体的一个重要指标,它直接关系到制剂的产业化和临床应用,对临床用药量较大的药物而言,载药量高是关键,因此,在脂质体制备过程中,应尽量提高脂质体的载药量。载药量通常按下式计算:DL/%=WE/WTotal×100。式中WE为脂质体中包裹的药物量,WTotal为脂质体的投料总重量。3批供试样品的测定结果(DL)分别为4.43%,4.52%和4.02%,平均值为(4.14±0.267)%。3脂质体混悬液结果发现方法I和方法II的包封率接近,并且药物包封率重现性不好,很不稳定,所含脂质的浓度不均一,从所得的脂质体混悬液中也可以看到不均匀的颗粒。而旋转薄膜-超声法(III)所制得的脂质体均匀,包封率高,且重现性好,旋转薄膜-超声法的包封率比其他方法相对高。薄膜-超声法和逆相蒸发超声法所得制剂的有关性状比较结果表明,薄膜-超声法制得的脂质体性状较好,故确定以旋转薄膜-超声法作为鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体制备工艺。3.1影响脂质成膜性的药物-磷脂一般情况下,药物-卵磷脂比越小,包封率越大,但药物-卵磷脂比1∶10的最好,因为类脂浓度达到一定程度后影响脂质的成膜性,从而影响药物的包裹。旋转薄膜-超声法药脂比对包封率的影响结果见图3。3.2提高脂质体中胆固醇的量实验结果表明,鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体包封率随着胆固醇的增加而升高,处方中胆固醇的含量越高,药物的包封率越大,因胆固醇可增加膜强度而利于药物的包裹,直接影响脂质体的结果。有报道对水溶性药物来讲,适当提高脂质体中胆固醇的量,可以增加脂质体中水相的体积,从而提高包封率。当胆固醇量足够大(1∶1)时,所得的脂质体胶态混悬液不下来,即使水浴超声后,所得脂质体混悬液也不均匀,有颗粒状物质,结果见图4。3.3不同溶媒对包封率的影响制备脂质体所采用的有机溶剂一般为乙醚、氯仿、二氯甲烷等,本实验考察了不同溶媒对包封率的影响,随使用溶媒的不同升高或降低旋转蒸发的温度。结果表明制备过程中所使用的有机溶剂对包封率或形态的影响不大,考虑到使用氯仿所残留的溶剂对身体有害,本实验采用二氯甲烷作为有机相。3.4超声强度的影响包封率随着超声时间的延长而变化,当超声时间为10min时,包封率最大。本实验采用水浴式超声(功率400W),处理时间为10min,超声波强度变化对包封率的影响,结果表明随着超声功率的增加,包封率呈下降趋势,超声强度在25%最合适。超声处理后形成稳定的W/O型乳剂,达到乳化的目的,但超声强度过高,可能导致脂质体被破坏,从而使包封率降低。4脂质体的物理和化学性质研究4.1鲜无治疗壁虎抗肿瘤活性成分的平均粒径将优化工艺制备的脂质体混悬液稀释到适当倍数,采用激光粒度分布仪测定脂质体的粒径大小及其分布,鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体的粒度分布测定,测定的上限为2μm,下限为0μm,测定结果:小于下限和大于上限的粒子数均为0,大部分粒子的粒径在0.06～1.1μm。由分析报告可知,鲜无蹼壁虎抗肿瘤活性成分脂质体的平均粒径为(355.6±51.2)nm,大小均匀,分布较窄,所考察的脂质体粒径均符合要求。本实验对脂质体的粒径及其分布进行了测定,测定结果表明,粒径大小(355.6nm)符合脂质体要求。4.2透射电镜观察取优化工艺条件下制备的脂质体混悬液,稀释一定倍数后,滴至专用铜网上,用1.5%磷钨酸染色后,自然晾干,于透射电子显微镜下观察粒子的形态,由透射电镜观察到,鲜无蹼壁虎醇提取物纳米脂质体呈类球形,均匀圆整,分散性好。显微镜以×48000倍观察时,脂质体为圆形或椭圆形,中心水层大,为深黄色,碎片很少,以复层脂质体为主,单层脂质体少数。4.3热压灭菌对脂质体的影响热压灭菌后发现脂质体很快变黄,且出现混浊沉淀,可能是温度太高,氧化太快的缘故,说明脂质体不能耐受热压灭菌。4.4质体的影响稳定性是脂质体质量的一项重要评价指标,辐射灭菌对脂质体的影响结果见表5。由结果可以看出,脂质体在经过60Co辐射灭菌后,其形态、大小及其包封率均无变化,说明对脂质体来说60Co辐射灭菌是一种很好的灭菌方法。4.5初始胶态状态的恢复冷藏条件下,脂质体在2个月内外观无变化,在3个月时有分层,但轻振摇可恢复初始胶态状态;室温条件下贮存时,在2个月内便出现不可逆沉淀现象,颗粒变大,说明在室温条件下放置脂质体不稳定,包封率下降显著,而在冷藏条件下,包封率变化不大,脂质体需在冷藏条件保存。实验方法的选择脂质体是近年发展起来的新型生物技术,可以增加组织穿透力,提高药物相容性,减缓释放,减少全身毒性。包封率是考察脂质体质量的重要手段,包封率的测定方法有透析法、离心法和凝胶过滤法。前2种方法有一定的局限性。透析法不适用于除去