光激化学发光免疫分析技术快速检测总前列腺特异性抗原

光激化学发光免疫分析技术快速检测总前列腺特异性抗原

前列腺特异性抗体（psa）是一种由前列腺上皮细胞产生的大约34天的大型单链糖蛋白。它是精子的主要成分，血液中含量小，有很高的组织和器官特异性。肿瘤发生时,前列腺和淋巴系统间组织屏障破坏,前列腺内容物进入血循环,血中PSA含量升高,因此测定血清中PSA含量在前列腺癌的早期诊断、疗效观察和预后判断等方面具有重要价值,被认为是目前诊断前列腺癌最敏感的指标。常用的检测方法有定性的酶联免疫吸附法(ELISA)、定量的化学发光免疫法(CLIA)、放射免疫分析法(RIA)以及时间分辨荧光免疫法(TRFIA)等。光激化学发光免疫分析(AlphaLISA)技术起源于LOCI(luminescentoxygenchannelingimmunoassay)技术,因其独特的检测方法,使整个过程灵敏度高,线性范围宽,特异性强,性质稳定、上样量少,免洗板,快速简便、易于微型化自动化等优点,是超微量检测分析的又一工具。本研究采用该新型技术,并运用双抗体夹心法快速检测血清中总前列腺特异性抗原(tPSA),并与其他检测tPSA试剂盒比较,进行初步临床评价。1材料和方法1.1仪器和试剂两株配对tPSA单克隆抗体为芬兰medix公司产品,tPSA抗原购自美国Biodesign公司;tPSA质控血清为美国Biorad产品;生物素购自于Sigma公司;受体微球、链霉亲和素化的供体微球和96孔微孔板为美国PerkinElmer公司产品;检测仪为美国PerkinElmer公司的2300EnSpireTM检测仪。总PSA时间分辨免疫荧光检测试剂盒(TRFIA)来自广州中山大学达安基因股份有限公司。45例阴性样本、45例阳性样本、136份血清样本和386份正常人血清皆来自广州南方医院。1.2方法1.2.1稀释液的制备稀释tPSA抗原至浓度分别为0ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、150ng/ml系列浓度,稀释液为含50mmol/LTris-HCl,1.5%BSA,0.9%NaCl,0.05%NaN3,0.01%Tween-20,pH7.8的反应缓冲液。1.2.2抗体反应时间的合成将0.2mgtPSA抗体加入Millipore公司的带有滤膜的离心管中,以9000×g离心8min,用缓冲液(0.13mol/L,pH8.0PBS)重复洗涤6次后收集抗体,在抗体溶液中加入1mg受体微球、10μl25mg/mlNaBH3CN(用缓冲液配制,现配现用)、1.25μl10%Tween-20,而后用缓冲液将体积补充到200μl,37℃避光振荡反应48h。最后加入10μl65mg/mlCMO(用0.8mol/LNaOH配制,现配现用)。37℃避光孵育1h封闭未结合位点,离心洗涤,得到已连接抗体的受体微球,调整受体微球浓度为5mg/ml。1.2.3抗体溶液的配制将0.5mg抗体加入到Millipore公司带有滤膜的离心管中,以9000×g离心8min,每次用200μl缓冲液(0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3,pH9.5),重复洗涤6次后收集抗体,调整抗体浓度为20mg/ml。在抗体溶液中加入2μl22mg/ml生物素(用DMSO配制,现配现用),室温振动孵育4h。利用PBS(pH7.4)4℃透析24h,每6h换液1次,收集透析袋中液体,将其抗体浓度调整为0.5mg/ml。1.2.4检测信号值的测定将5μl标准品或待检测样品加入微孔板中,并分别加入以分析缓冲液1∶50比例稀释的已连接抗体的受体微球25μl、1∶300比例稀释的生物素化抗体25μl,37℃振动孵育15min,然后在避光条件下加入链霉亲和素化的供体微球175μl,37℃振动孵育15min后在2300EnSpireTM检测仪上检测信号值。2结果2.1tpsa光激化学发光免疫检测试剂的剂量—剂量-反应曲线以自制试剂盒中参考标准品浓度的对数为横坐标,信号值1×103计数的对数为纵坐标,由双对数数学模型Log-Log函数处理,测得tPSA试剂盒剂量-反应曲线线性相关系数为r=0.999(图1),表明自制tPSA光激化学发光免疫检测试剂具有良好的剂量反应。当浓度升高时,出现HOOK效应(图2)。2.2回收率的测定将Biorad的质控品Ⅰ、Ⅲ及Ⅰ与Ⅲ等体积混合液分别进行测定,各设三个复孔,计算质控品的回收率。即质控品Ⅰ与Ⅲ等体积混合液测定值与(质控品Ⅰ+Ⅲ)/2的比值。结果见表1,自制试剂回收率为99.79%,符合准确度要求。2.3标准曲线方程的灵敏度以零参考标准品测定值(n=20)的均值加上2倍的标准差后得到信号值,将其代入标准曲线方程计算所得为分析灵敏度,其值为0.006ng/ml。标准曲线的线性范围0.006~150ng/ml。2.4重复测定实验采用美国Biorad公司提供tPSA低、中、高三个质控品(编号分别为54501、54502、54503),各设10个复孔,同一次实验内和不同实验中重复多次测定。自制试剂分析内变异系数为3.90%~6.67%,分析间变异系数为4.70%~6.90%,精密度良好(表2、表3)。2.5特异性将一定浓度的AFP,CA12-5,CA19-9,人白蛋白作为样品用自制tPSA试剂测定,结果见表4。2.6浓度为4.0酸386份正常人血清,检测最低值为0ng/ml,最高值为6.25ng/ml,平均浓度为1.32ng/ml,标准差为1.27ng/ml。从表5可见,在浓度值为4.00ng/ml以下时,包含了98.2%的样本。综合他人的研究及临床现行参考,我们建议设定本试剂检测时的tPSA血清正常参考值范围为0~4.00ng/ml。使用时根据各地区样本的差异,建议设定自己的参考值范围。2.7自制试剂检测结果阴、阳性血清标本各45份,分别用自制tPSA光激化学发光免疫分析试剂和罗氏电化学发光诊断试剂盒tPSA进行测定,结果显示,两种诊断试剂的阳性符合率和阴性符合率均为100%,说明自制试剂用于临床检测时准确度高。两种检测方法所得阴、阳性血样数值有显著相关性,AlphaLISA=1.187ECL+0.01,r=0.987,P<0.001(图3)。136份临床血样同时用自制试剂与ECLIA进行平行检测,对所测数值进行相关性分析,结果显示两种方法所得的数值有显著相关性,AlphaLISA=1.141ECL-1.005,r=0.979,P<0.001(图4)。比较常用方法的检测性能(表6),可以看出光激化学发光免疫分析试剂在检测性能指标上与电化学发光免疫分析试剂盒、时间分辨荧光免疫分析试剂盒无明显差异。3光激化学发光免疫分析法psa法的应用PSA是一种丝氨酸蛋白酶,属于激肽释放酶家族,能快速水解大分子精液中的凝固蛋白,具有酶活性的PSA主要受蛋白酶抑制剂的调节。a1抗糜蛋白酶(anti-chymotrysin)和a2巨球蛋白(a2-macroglobulin)是肝脏产生的两种主要丝氨酸蛋白酶抑制剂,PSA与它们分别结合形成稳定的结合物(PSA-ACT和PSA-AMG)而失去酶的活性。其中与ACT结合是血清中PSA复合体的主要形式,与a2巨球蛋白结合的PSA由于不具有免疫活性而不能被测定。除结合型PSA外,血清中还存在较少比例的游离型PSA(20%),游离型PSA(fPSA)即活性PSA形式。临床上测定总PSA包括血清中游离型PSA和结合型PSA(PSA-ACT)。目前临床所用的检测试剂大多为进口试剂,费用贵,不利于临床广泛应用,限制了前列腺增生、前列腺癌等疾病所要求的早期诊断、早期治疗,尤其是在接近cut-off值(灰区)区域内,准确检测血清中tPSA的含量,对疾病分型,随后的治疗方案选择有很重要的参考意义。光激化学发光免疫分析法是一种通过化学发光检测微球间的结合,进而检测分析物含量的方法。在680nm的光照下,供体微球中的光敏物质受到激发产生单线态氧,单线态氧扩散至受体微球,与其中的发光物质反应后产生615nm的化学发光。由于单线态氧在溶液中维持活性的时间很短(约4μs),只能扩散约200nm的距离,因此只有那些通过待测物质连接在一起的受体微球和供体微球才能产生化学发光。该技术实现了均相免疫测定,操作过程简便,避免了酶联免疫吸附法、时间分辨荧光免疫分析法等检测方法中的分离和洗涤过程,耗时短,可在35min内完成,完全可用于临床急诊检测。且比以往的非均相免疫分析(如ELISA、时间分辨荧光免疫分析)省样本(低至5μl),操作简便,更易实现自动化、小型化;整个操作过程不易受pH值,温度等外界因素的干扰,保证了检测的稳定性和可重复性。本研究旨在应用光激化学发光免疫分析法来定量检测人血清中的tPSA。有文献报道tPSA含量年增高值>1μg/L就有意义。实验结果显示,分析灵敏度为0.006ng/ml,远远高于国外电化学发光试剂的0.05ng/ml,不仅能节约待测样品(只需5μl),也有利于减少样品对分析系统的干扰。检测上限低于进口电化