硕士研究生课-高级生物化学-DNA测序及基因组课件

Chaper4DNA测序及基因组测序策略Chaper4DNA测序及基因组测序策略1结构基因组学的核心内容之一是基因组测序。随着人类基因组图谱的完成,人类基因的定位克隆、鉴定分析直至全基因组测序均取得了突破性进展,测序策略的成熟、测序方法的改进、自动测序仪的广泛应用、计算机数据分析系统的扩展以及测序分析能力的提高,大大推进了大规模DNA测序的进程。结构基因组学的核心内容之一是基因组2DNA测序的基本方法■链终止法测序■化学降解法测序■自动化测序1非常规DNA测序DNA测序的基本方法31、链终止法测序(thechainterminationmethod1)基本原理1977年Sanger提出了“终止法”。其反应体系包含单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶,分四组进行,每组按一定比例加入一种2’,3'双脱氧核苷三磷酸,它能随机掺入合成的DNA链,一旦掺入合成即终止,于是各种不大小片段的末端核苷酸必定为该核苷酸,经变性胶电泳,可从自显影图谱上直接读出DNA序列1、链终止法测序(thechainterminatio4dNTPOHPP-P-ICHOHDMA聚合酶P一口口ooH—口口口口口口口合日日PP口口口口口Ⅷ0参入0口口口口口口q日日合P路止PP-PP—口口了口口姍0班·Klenow*段0H-口口口口口口q口合PdeNT参入P口口口口而■0口口口口口口口日日PP一口画■KLenow序段0H口口口口口口口口口口PdNTPOH52)技术路线与要求制备单链模板克隆于质粒中DNA→用碱或热变性BM13克隆单链D将单链模板与一小段引物退火噬粒克隆DNADPCR产生单链DNAA高酶活性加入DNA多聚酶B无5→3外切酶活性4种脱氧核苷酸C无3'→5外切酶活性ddATP/ddcTP/ddGTP/分别加入少量4种双脱氧核苷酸dP的3碳原子连接的是氢原子,不是羟基将4种反应产物分别在4条泳道电泳根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列2)技术路线与要求6引物链模板链①将反应分为4组,每组均加入有放射性标记的4种dNTPdCTP.dGTP.dTP,dmP②每组分别加入各自的A组G组组dNTP如組加入dTP●dP+ddTTPaAmT∞趾H:F"③如果遇到ddNTPDNA合成c终止于是在各组中产生长短"不同的以该坦dNTP结束的DNA片段长片段在上④反应结東,迸行凝胶电泳A然后用Ⅹ胶片对其曝光短片段在下5⑤显影然后自胶片上自下而上于的排好字母顺序,这个序列就是DNA5→3的碱基顺序引物链7化学降解法测序(Maxan和Gibert于1977年发明1)基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基团,再用化合物处理,使DNA分子在被修饰的位置降解化学降解法测序(Maxan和Gibert于8)技术路线将双链DNA样品变为单链每个单链的同一方向末端都用放射性同位素标记,以便显示DNA条带分别用不同方法处理,获得只差一个核苷酸的降解DNA群体电泳读取DNA的核苷酸顺序)技术路线93)Maxam-Gilbert法所用的化学技术①先用限制性内切酶把DNA切成10200bp的测序材料;②用碱性磷酸化酶处理该片段,消除5末端上的磷酸;③在5oH端标记32P,用多核苷酸磷酸激酶催化;④标记片段变性为单链;⑤用特异的化学试剂作用于不同的碱基进行修饰,然后用哌啶切断反应碱基的多核苷酸链,紧接着用四组不同的特异反应可以使末端标记的DN切成不同长度的片段生一组其末端都是该特异碱基的长度不等的DNA片段⑥经电泳和放射性自显影后,从4个反应系统统一阅读,待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出3)Maxam-Gilbert法所用的化学技术10硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件11硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件12硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件13硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件14硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件15硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件16硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件17硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件18硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件19硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件20硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件21硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件22硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件23硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件24硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件25硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件26硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件27硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件28硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件29硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件30硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件31硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件32硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件33硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件34硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件35硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件36硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件37硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件38硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件39硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件40硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件41硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件42硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件43硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件44硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件45硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件46硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件47硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件48硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件49硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件50硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件51硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件52硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件53硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件54硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件55硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件56硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件57硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件58硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件59硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件60硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件61硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件62硕士研究生课——高级生物化学-DNA测序及基因组课件63硕士研究生课——高