流式细胞术的原理与应用课件

流式细胞术原理和应用王秀莉2011.9.30一

简介二构造及工作原理三FCM的数据分析FCM的应用实例举例：细胞周期分布检测流路(液流系统）流动室 鞘液SHEATH样本流SAMPLE单细胞悬液5*105~1*106个/ml光路（光学系统）光源滤片电路（检测系统）光电倍增管PMT放大电路HV及GAIN增益A/D转换统计（分析系统）计算机二构造及工作原理

流动室是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃钢制成，并在石英玻璃中央开一个孔径为430μm×180μm的长方形孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，这种流动室的光学特性良好，流速较慢，因而细胞受照时间长，可收集的细胞信号光通量大，配上广角收集透镜，可获得很高的检测灵敏度和测量精度。液流系统流动室InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid液流系统激光光源：目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。激光(laser)是—种相干光源，它能提供单波长、高强度及稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。由于细胞快速流动，每个细胞经过光照区的时间仅为1μs左右，每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞需要足够的光照强度。

光学系统信号散射光信号

FS细胞大小

SS细胞颗粒性荧光信号

FL1–FITC

FL2–PE

FL3–ECD

FL4–PC5光学系统散射光信号——细胞大小及颗粒性FSSS光学系统光路（滤片特性）光学系统流式细胞仪光路图Air-cooledArgonIonLaserBeamShapingLensesHighSensitivityQuartzFlowCellForwardScatterDetectorSideScatterDetector525BPFL1(FITC)575BPFL2(PE)620BP

FL3(ECD)675BPFL4(PC5)488DL488BK550DL600DL645DL光学系统电路电压调节光电倍增管电压volts增益Gain信号放大方式检测系统电信号输入到放大器放大，放大器分两类：线性放大和对数放大。细胞DNA含量、RNA含量等的测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表面抗原等的检测时，细胞膜表面抗原的分布有时要相差几十倍，甚至几万倍，通常使用对数放大器。

检测系统常用荧光染料介绍FITC：绿色525nmPE：橙黄色575nmECD：橙红色610nmPE－CY5：深红色675nmPerCP：深红色675nmPE－CY7：深红色755nm7AAD：深红色675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm 488nm波长的氩离子激光激发光路补偿

FITC/PE/ECD/PC5三FCM的数据分析单参数一维直方图纵坐标表示细胞数，横坐标表示相对荧光信号或散色光信号值，单位是道数。2.双参数二维点图显示来自同一细胞的两个参数与细胞数量间的关系。横、纵坐标分别表示两个参数的相对含量。通过分别计算两坐标所表示参数的阳性率来得到实验结果。3.等高线图4.密度图白血病免疫分型HLA-B27:强直性脊柱炎淋巴细胞亚群造血干细胞计数：造血干细胞移植网织红细胞PNH诊断（CD55、CD59）血小板活化试验1流式细胞术的临床应用四FCM的应用细胞大小细胞的颗粒度细胞表面分子：CD系列细胞浆内分子：胞内细胞因子细胞核内分子：P53细胞功能检测：细胞周期、凋亡2流式细胞术的科研应用荧光信号的定量可以用平均荧光强度（mean值），荧光信号面积（Area，A）来表示。1）蛋白表达的检测2）DNAAnalysisPIEthidiumBromideAcridineOrangeDAPI(UVexcitable)Hoechst33342(viable,UVexcitable)不能主动进入细胞，需要固定打孔488nm激发为脂溶性，主动进入细胞UV激发常用的DNA染料02004006008001000G0G1sG2MDNAAnalysisCount2N4NG2MG0G1s02004006008001000PIFluorescence2N4NDNAAnalysis3）Apoptosis检测A）DNA片断化检测细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成50~300kbp长的DNA大片段,或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段B）Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。C）AnnexinVAssay磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中,Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合AnnexinVAssay能够区分死亡与凋亡D）TUNEL

细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记