基因重组与分子生物学技术

基因重组与分子生物学技术

GeneticrecombinationandThetechniqueofMolecularbiology第十三章第一节自然界的基因转移和重组接合作用

(conjugation)转化作用

(transformation)转导作用

(transduction)转座

(transposition)基因重组位点特异的重组(sitespecificrecombination)同源重组(homologousrecombination)

可接合质粒如F因子(Ffactor)定义

当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。质粒------细菌染色体外的小型环状双链DNA分子一、接合作用(conjugation)二、转化作用(transformation)定义

通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。例：

溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取三、转导作用(transduction)定义

当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。例λ噬菌体的生活史溶菌生长途径（lysispathway）溶源菌生长途径（lysogenicpathway）四、转座

(transposition)定义：由插入序列（IS）和转座子介导的基因移位或重排称为转座。（一）细菌转座1.插入序列转座插入序列组成：二个分离的反向重复序列9~41bp特有的正向重复序列4~12bp一个转座酶基因发生形式：保守性转座插入序列移动到新的位置

复制性转座插入序列复制后一个拷贝移到新位置，另一个仍保留在原位。IR转座酶基因IR正向重复序列反向重复序列复合转座子转座复合转座子的中央区带有抗药性遗传标记IRIR转座酶基因抗药基因转座子转座与细菌相似，在转座过程仅与DNA形式出现

逆转座子转座与逆转录病毒产生的前病毒有关，转座过程须通过特定的RNA中间物(二)真核生物转座子五、基因重组定义

在接合、转化、转导或转座过程中，外源DNA与宿主DNA发生的共价连接，称基因重组。可分为同源重组

位点特异性组同源重组(homologousrecombination)

发生交换的两个DNA的对应区域的序列必须是相同或相似的（有同源性的）重组称为同源重组,又称基本重组例

E.coli的同源重组

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA连接酶5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`3`5`5`3`5`3`5`3`Holiday中间体5`3`5`3`5`3`5`3`Holiday中间体5`3`5`3`5`3`5`3`5`3`5`5`5`3`3`3`5`5`5`5`3`3`3`3`5`5`5`5`3`3`3`3`5`5`5`5`3`3`3`3`5`5`5`5`3`3`3`3`内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶位点特异的重组(sitespecificrecombination）

由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合例：

由λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色的特异靶位点；反转录病毒整合酶可特异地识别整合其cDNA的LTR；转座酶可特异识别转座子的反向末端重复序列。第二节基因重组DNA技术一、基因重组主要步骤1.获取目的基因2.外源基因与载体的连接3.重组DNA导入受宿主细胞4.重组体的筛选5.重组蛋白质在宿主细胞的表达二、限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)定义：识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA分类：Ⅰ、Ⅱ(重组DNA技术中常用)、ⅢGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠⅡ类酶识别序列特点——回文结构切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG配伍末端

有些限制性类切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同类型的粘性末端可进行相互连接。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTAAGATCCTCTAGG三、基因载体定义：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。克隆载体(cloningvector)-----为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体表达载体(expressionvector)-----为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体常用载体

质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA质粒(

plasmid)特点

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,如可赋予宿主细胞一些遗传性状。

λ噬菌体DNA改造系统

λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）

EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）

M13mp系列

PUC系列噬菌体（phage)柯斯质粒载体(cosmidvector)、酵母人工染色体载体(YAC)、动物病毒DNA(如腺病毒，逆转录病毒)改造的载体其他：第三节基因重组基本过程一、目的基因的获得1.化学合成法

要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列

2.基因组DNA

基因组DNA文库(gennomicDNAlibrary)3.cDNAcDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction，PCR)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库

存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合。mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子含重组DNA分子的受体菌反转录酶载体受体菌复制二、基因载体的选择和构建根据目的选择或构建相应的载体需符合下列条件1.有多种限制酶的单一酶切位点；2.可容纳较大的外源DNA片段；3.在宿主细胞中能独立复制，稳定保存；4.有遗传标记用于重组体筛选三、目的基因与载体的连接1.粘性末端连接——DNA连接酶催化

方式：同一限制酶切割位点连接配伍末端连接3.同聚物加尾连接由末端转移酶加同聚物序列再粘端连接2.平端连接

DNA连接酶催化

适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端人工接头：

由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。人工连接头及其应用四、重组DNA导入受体细胞 ：

受体菌条件:安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态

导入方式：转化(transformation)

转染(transfaction)

感染(infection)五、重组体的筛选（一）依据重组子遗传表型特征１.抗药性标记选择２.标志补救如α互补（二）依据重组子结构特征分子杂交法原位杂交，Southern印迹（三）免疫学方法

如免疫化学方法酶免检测法插入失活法α互补α互补的检测原位杂交Southern印迹鸡的β肌球蛋白的克隆和检出六、克隆基因表达

表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化1.原核表达体系E.coli

标准：选择标志;强启动子;翻译调控序列;多接头克隆位点。

E.coli不足：不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真和蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体很难表达大量可溶性蛋白

2.真核表达体系

酵母、昆虫、乳类动物细胞

优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA;可适当修饰表达的蛋白质;能稳定传代;表达产物分泌到培养基中,易提纯。

缺点：操作技术难、费时、经济转染-----将表达载体导入真核细胞的过程方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔脂质体转染显微注射

第四节

分子生物学实验技术

一、分子杂交与探针技术原理

核酸分子杂交

在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链（heteroduplex）的现象。复性RNADNA探针(probe)：

是以研究或诊断为目的，用于检测特定序列核酸的已知DNA或RNA片段印渍技术DNA印渍技术(Southernblotting)基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析RNA印渍技术(Northernblotting)

mRNA的分析蛋白质的印渍分析(westernblotting)

蛋白质定性定量及相互作用研究其他：

斑点印渍(dotblotting)

原位杂交(insituhybridization)

DNA点阵(DNAarray)

DNA芯片技术(DNAchip)放射自显影照片DNA点阵三、聚合酶链反应技术

（polymerasechainreaction

PCR）技术

1.PCR体系基本成分：

模板DNA

特异性引物

DNA聚合酶(耐热)

dNTP

含有Mg2+

5

引物A5

引物B第二次循环第一次循环5

5

5

5

5

5

模板DNA5

5

5

5

5

5

5

5

2.PCR反应的过程25~30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上第三次循环5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

5

PCR的基本反应步骤变性95ºC延伸72ºC退火Tm-5ºC目的基因的克隆基因的体外突变

DNA的微量分析3.PCR的应用四.核酸序列分析核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)(双脱氧终止法)第五节

基因诊断和基因治疗基因诊断利用现代分子生物