DNA分子遗传标记在中药中的应用

DNA分子遗传标记在中药中的应用

DNA分子遗传标记

广义的分子标记（molecularmarker）是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。常用的是狭义的分子标记概念，即DNA分子标记。DNA分子标记主要分为以下三类一、限制性片段长度多态性（RFLP）：是发展最早的分子标记技术，以分子杂交为核心技术。二、DNA序列测定三、基于PCR的分子标记：根据引物的选择可分为随机引物扩增和特定序列位点扩增。随机扩增多态性DNA（RandomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD）。随机引物扩增PCR（ArbitraryPrimer-PCR,AP-PCR）2、DNA扩增产物指纹分析（DNAamplificationfingerprinting,DAF）:与RAPD技术不同的是引物浓度更高，长度更短（5～8个bp），只有2个温度循环（在RAPD中是3个温度循环），一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳。3、特征扩增区段测序（Sequence-characterizedamplifiedregions，SCAR）：先做RAPD分析，然后克隆目标RAPD片段进行测序，根据RAPD片段两末端的序列设计特定引物（一般比RAPD引物长，24bp），再进行PCR扩增，可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来，可重复性高。RFLP技术及其应用

RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性内切酶切片段长度多态性)是70年代发展起来的DNA片段分析技术。该技术不仅在生物学、医学、农学的许多领域都有了成功的应用，而且在中药材品种基源及其地理品系、栽培品系的质量评价方面也有许多应用。基本原理

生物在进化过程中，由于种种原因引起基因突变和DNA分子结构重排，造成了分子内核苷酸排列顺序的改变，当这种改变涉及到限制性酶切位点时，酶切后产生的DNA片段长度将发生变化，限制性片段的长度在不同个体间呈多态性现象，即称为限制性片段长度多态(RestrictionFragmentLengthPolymorphism,简称RFLP)RestrictionFragmentLengthPolymorphism(RFLP)EnzymescutDNAatspecificsequencesRestrictionsitesareoftenpalindromes:6-cutterGAATTC 4-cutterTCGACTTAAG AGCTDNA多态性根据其产生的两种基本方式碱基对突变类型(基因点突变),即限制性内切酶识别位点上发生了单个碱基替换(转换或颠换)，使原有切点消失或产生新的切点。结构重排型，这是由DNA内部发生较大的顺序变化所引起的。RFLP与镰状细胞贫血基本实验步骤靶DNA的准备核酸探针的标记杂交显示RFLP的优点及局限性

优点：(1)普遍存在(2)稳定性(3)共显性(4)探针与限制酶的组合数量无限局限性：（1）用RFLP仅能检测出影响到限制性内切酶识别位点的突变（2）步骤多，工作量大，而且接触的放射性污染也多（3）RFLP分析技术要求DNA无显著降解，因此只适用于新鲜的材料，难适用于干燥药材的鉴别（4）限制性内切酶价格较贵

RFLP用于亲缘关系分析“Ladder”RFLP在中药材鉴别中的应用

（一）近缘种的鉴别如：海马的PCR-RFLP分析

（二）药用植物亲缘关系的研究如：羽扇豆属植物系统发育关系及与生物碱分布的关系

RAPD技术及其应用

RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA，随机扩增多态性DNA)技术是1990年由杜邦公司Williams和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项DNA多态检测技术。该技术高效、灵敏、简便、快速，一经出现就被普遍用于物种种属分类、亲缘关系分析、物种起源鉴定、目的基因筛选、农作物育种等研究领域。近年，RAPD技术又进入了中药材的鉴别研究领域，并得到广泛应用，已成为目前用于中药材鉴定报道最多的分子遗传标记技术。RAPD技术基本原理RAPD的核心技术是PCR反应，但又不同于经典的PCR。它是以任意序列的寡核苷酸为引物进行PCR扩增，Williams称之为RAPD，引物通常为10个碱基；Welsh称之为AP-PCR(ArbitraryPrimerPCR)，引物为20～30个碱基。对于任一引物，如在一定范围内模板DNA上有与之互补的反向重复序列时，就可扩增出此范围的DNA片段。RAPD:randomlyamplifiedpolymorphicDNA基本实验步骤

模板DNA的制备PCR扩增，通常RAPD扩增条件为：93℃预变性200s，开始如下循环：94℃变性lmin，36℃退火1min，72℃延伸2min；经过40个循环后，72℃延伸5min，循环结束后反应产物置于4℃保存。扩增产物20μl反应产物走凝胶电泳，经溴化乙锭染色检测扩增的情况RAPD图谱的数据处理RAPD分析的优越性和不足优越性：(1)无需预知被研究的生物基因组核苷酸顺序，也无需专门设计RAPD扩增反应的引物，引物随机合成或是任意选定的,长度一般为9-10个寡核苷酸；(2)扩增没有特异性；(3)退火温度较低，一般为36℃，这能保证短核苷酸引物与模板的稳定配对，同时也允许了适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNA中配对的随机性。(4)简便易行，省力省时。（5）检测灵敏方便；（6）所需样品DNA量极少，仅为10ng,为RFLP的1/l000～l/2000。（7）能自动化。不足：（1）重复性不高。RAPD在扩增反应时使用的是低温复性(通常为36℃),特异性不高,引物与模板间有较高的错配率,结果容易受到多种因素的影响,不同的实验室这间有时不能重复；（2）对模板DNA质量要求高，操作要求严格，检验成本相对较高；（3）由于存在共迁移，分子量相同的片段可能不是同源的；另外一条带中可能含有不同的扩增产物；（4）RAPD标记难以区分开杂合子和纯合子基因型，不能有效的鉴定出杂合子。M12345678910111213141516不同Mg2+和dNTP浓度对RAPD带型的影响123456789101112M不同Taq和Primer浓度对RAPD带型的影响M12345678910111213

M13141516171819202122232425不同循环量和模板DNA浓度对RAPD带型的影响

M123456CK789101112

不同复性温度对RAPD带型的影响图4不同复性温度对RAPD带型的影响Fig4EffectonRAPDprofilesindifferentannealingtemperature

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不同复性温度对RAPD带型的影响RAPD分析在中药研究中的应用

道地药材的评价

例：当归药材道地性的RAPD分析野生与栽培种及不同农家品种亲缘关系分析例：人参及山参RAPD指纹动物药的鉴定

例：蛇类药材分子遗传标记鉴别的研究AFLP技术及其应用

扩增酶切片段多态性(AmplifiedRestrictionFragmentPolymorphism)是一种基于PCR的DNA指纹技术，AFLP是近几年来继RFLP、RAPD之后发展最快的DNA分子标记技术。被誉为新一代的分子标记技术，近年来已得到广泛的应用。AFLP基本原理

AFLP的基本原理是对基因组DNA限制性酶切片段进行选择性扩增。先将基因组DNA用限制性酶消化，产生粘性末端。然后使用人工合成的双链接头（artificialadapter）,与基因组DNA的酶切片段相连接形成扩增反应的模板。接头和与接头相邻的酶切片段的几个碱基序列作为引物的结合位点。AFLP反应的结果是主要扩增那些由上述两种酶共同酶切的片段。基本实验步骤

模板的制备：即DNA酶切及人工接头的连接（RestrictionoftheDNAandligationofoligonucleotideadapters）限制性片段的选择性扩增（Selectiveamplificationofsetsofrestrictionfragments）扩增产物凝胶电泳分析（Gelanalysisoftheamplifiedfragments）AFLP的实验过程AFLP反应流程：AFLP反应程序主要包括模板DNA制备，酶切片段扩增及凝胶电泳分析这3个基本步骤。各步骤具体的过程有：首先要制备高分子量(HMW)基因组DNA，选择6个碱基识别位点的限制性内切酶(通常是EcoRI或PstI或SacI)。酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带