心肌缺血再灌注损伤的研究进展

心肌缺血再灌注损伤的研究进展

心肌缺血（mi）是指由各种原因引起的动脉血流量减少、心肌氧气和其他物质的供应不足，以及代谢产物的减少。近年来,动脉搭桥术、溶栓疗法、经皮腔内冠脉血管成形术、体外循环心脏外科手术和心肺脑复苏术等手段的建立和推广应用,使得缺血心脏能在短时间内重新获得血液灌注并恢复氧供应。多数情况下,缺血后再灌注可使损伤的结构得到修复,心功能恢复,病情好转;但有时不仅不能使心功能恢复,反而会加重心脏功能障碍和结构损伤。这种在心肌缺血基础上恢复血流后组织损伤加重、甚至发生不可逆性损伤的现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardialischemia-reperfusioninjury,MIRI)。已有大量研究显示,MIRI与钙超载、能量代谢和细胞凋亡等过程密切相关,其中所涉及到的一些关键性物质有一氧化氮(NO)合酶(NOS)、氧自由基、细胞间黏附分子-1、肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)、p53蛋白及Bcl-2蛋白家族等。通过不断探索,研究人员已发现一系列可通过不同的作用机制预防MIRI,保护缺血心肌的化合物及药物,如促红细胞生成素(NOS激动剂)、维生素E和维生素C(自由基清除剂)、SEA0400(1,钠钙交换抑制剂)、葛根素(可改善心肌能量代谢)、麝香醒脑宁(可抑制TNF-α表达)及麝香保心丸(抗心肌细胞凋亡)等。虽然关于MIRI的报道已有很多,但其发病机制过于复杂,人们对MIRI的现有认识相对有限,临床上亦缺乏理想的治疗药物。本文就近年来国内外科研工作者在MIRI的病理机制和治疗药物方面的研究进展作一综述,旨在为MIRI治疗药物的进一步研究开发提供参考和思路。1内源性因素对细胞信号传导途径的影响目前,学术界普遍认为,MIRI与L-精氨酸、5-脂氧合酶(5-lipoxygenase,5-LOX)、高温需求蛋白A2(hightemperaturerequirementA2,HtrA2)、线粒体内膜通透性转换孔(mitochondrialpermeabilitytransitionpore,MPTP)、细胞色素P450单氧化酶/环氧-二十碳三烯酸(EET)系统及P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activatedproteinkinase,P38MAPK)等内源性因素参与的细胞信号传导途径密切相关。1.1la-精氨酸为直接补充的nvcm-ros后,积极Venardos等近来提出,在MIRI发生时用于合成NO的L-精氨酸会不足,这是导致MIRI继续恶化的关键因素。该课题组发现新生大鼠心室肌细胞(neonatalratventricularcardiomyocytes,NVCM)在缺氧3小时再恢复给氧2小时后,对L-精氨酸的摄取量和NO水平分别下降至正常NVCM的42%±2%和71%±4%(P<0.01)。同时,线粒体膜电位会下降至正常组的66%±5%(P<0.01),而活性氧(Reactiveoxygenspecies,ROS)的水平则增加至正常NVCM的129%±4%(P<0.01)。转染了携有L-精氨酸转运体CAT1基因的腺病毒的NVCM与补充了L-精氨酸的NVCM在缺氧3小时再恢复给氧2小时后,NO水平分别为正常NVCM的90%±1%和86%±1%(正常NVCM为74%±1%,P<0.001);线粒体膜电位分别为正常NVCM的86%±1%和82%±1%(正常NVCM为73%±1%,P<0.001);ROS的产生和乳酸脱氢酶的释放分别为正常NVCM的51%±8%(P<0.01)和65%±9%(P<0.05)。在体外试验中,在缺血后再灌注的小鼠心脏灌流液中加入L-精氨酸,结果,心肌细胞中Akt激酶的磷酸化水平显著高于空白对照组(P<0.05),提示L-精氨酸保护MIRI的机制与其激活Akt激酶磷酸化有关。综上,可认为L-精氨酸水平降低是MIRI发病机制中的一个关键性因素,通过加强CAT1表达来上调L-精氨酸水平或者直接补充L-精氨酸均可改善MIRI。但并不是任何时候补充L-精氨酸都能起到减少MIRI的效果,据报道,只有尽早补充L-精氨酸(于再灌注前10min至灌注后50min期间内给药)才能加强左心室功能;相反,较迟补充L-精氨酸(于再灌注后3小时给药)则会增加过亚硝酸盐的形成,从而加剧心肌功能损伤。1.25miri相关的炎症反应当缺血再灌注发生时,5-LOX可转移、聚集至缺血再灌注器官,并促使花生四烯酸转化为白三烯,后者可引发炎症反应并加剧器官的缺血损伤,故很多人认为5-LOX在心肌缺血再灌注发生后的炎症反应中亦起重要作用。但近来也有人认为MIRI不同于其他类型的缺血再灌注损伤,且5-LOX在MIRI相关的炎症反应中并无作用。如Adamek等分别取5-LOX基因缺陷的小鼠和正常的野生型小鼠,在结扎冠状动脉30分钟后解除结扎,使之再灌注,结果,24小时时两组小鼠的心肌梗死面积并无明显差别(61.7%±3.9%vs55.8%±6.6%,P>0.05),而5-LOX基因缺陷型小鼠梗死心肌的中性粒细胞数量显著高于正常组小鼠(P=0.006),且肿瘤坏死因子表达量上调,使MIRI引起的缺血后炎症反应情况加重。1.3胞色素因子HtrA2为一种丝氨酸蛋白酶,是MIRI致心肌细胞凋亡的关键性物质。其通常位于线粒体膜间隙,当MIRI发生时,心肌细胞的线粒体膜完整性受到破坏,HtrA2和细胞色素C随之从线粒体膜间隙转移至细胞质中。流入细胞质中的细胞色素C会与脱氧腺苷三磷酸(dATP)、凋亡蛋白酶活化因子1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1,Apaf-1)及Caspase-9前体结合成为一个凋亡小体,从而激活Caspase-9和Caspase-3。X-染色体连锁凋亡蛋白抑制因子(X-chromosome-linkedinhibitorofapoptosisprotein,XIAP)可抑制Caspase-9前体、Caspase-9、-3及-7的活性。而流入细胞质中的HtrA2可与XIAP结合并促使其降解,从而激活Caspase-9、-3和-7,促进细胞凋亡(见图1),提示抑制HtrA2的表达可有效阻止MIRI导致的心肌细胞凋亡。1.4vdac在心肌梗死再灌之间的协同作用MPTP是位于线粒体内的非选择性、高导电性复核孔道,主要由线粒体外膜上的电压依赖性阴离子通道(voltagedependentanionchannel,VDAC)、内膜的腺苷酸转移酶、基质和亲环蛋白D等组成。VDAC参与维持线粒体膜的通透性,且在细胞凋亡和死亡中也起着重要作用。近来研究表明,心肌缺血再灌注期间MPTP会开放。而环孢素A(cyclosporinA,CsA)可阻止其开放,Xie等将大鼠分为2组,分别给其静脉注射CsA(10mg·kg-1)或空白溶剂,10分钟后结扎其冠状动脉左前降支,30分钟后解除结扎,使之再灌,并于再灌180分钟后测定大鼠心肌梗死面积。结果显示,相比于溶剂对照组,CsA组大鼠心肌梗死面积显著减少(30.3%±2.7%vs48.8%±5.8%,P<0.05),提示CsA可能通过抑制MPTP开放来保护心血管,且证明MPTP在MIRI导致的心肌缺血死亡中起重要作用。1.5单氧化酶抑制剂单次灌注氧自由基增多、钙超载和白细胞激活是公认的MIRI机制,而细胞色素P450单氧化酶在参与氧化还原反应的过程中往往可激活分子氧并产生自由基,故与MIRI的发生有密切关系;此外,心肌缺血可引起磷脂分解并产生花生四烯酸,后者可通过细胞色素P450单氧化酶代谢途径代谢为4种EETs:5,6-、8,9-、11,12-和14,15-EET。EETs是一种内皮衍生性超极化因子,具有促进内皮细胞增殖、抗血栓形成、激活心肌ATP敏感性钾通道、调控L-型钙通道、抑制钠通道以及调节MAPK等功能。心肌缺血再灌注发生时血液中EETs水平显著上调,提示P450单氧化酶/EETs系统对MIRI有一定影响,但部分观点认为其可加重MIRI,如Moffat等发现5,6-EET及11,12-EET可使细胞内钙离子浓度持续升高引起钙超载,从而延迟离体豚鼠心脏缺血再灌注时心功能的恢复时间,Granville等发现,P450抑制剂氯霉素可减少离体大鼠心脏缺血再灌注后的心脏梗死面积;另一部分人则持相反观点,如Seubert等报道称CYP450亚型CYP2J2高表达及EETs的增加可改善MIRI。另外,也有人发现细胞色素P450ω-羟化酶及其催化花生四烯酸产生的19-和20-羟烷四烯酸可加重MIRI。1.6对miri的调节机制商MAPK信号转导系统可将细胞外信息传递到细胞内,以介导细胞产生各种反应,P38MAPK蛋白是MAPK信号转导系统中的重要组成部分,其对MIRI亦存在双重调节机制:一方面,在MIRI发生时,P38MAPK可通过介导Caspase-1、-3和-11的激活及参与Fas/Fas-L信号传导途径等方式来促使心肌细胞凋亡并加重MIRI;另一方面,在MIRI发生时,P38MAPK的激活会导致胞内小热休克蛋白(α-B晶体蛋白)在59位丝氨酸发生磷酸化,抑制MPTP开放,从而保护心脏免受MIRI的损伤。2治疗心肌缺血，再注射损伤药物的开发2.1uf-119对小鼠心肌细胞凋亡和心肌梗死的影响Cilenti等报道了一种对HtrA2有高度选择性的抑制剂——ucf-101(2),其在体外对HtrA2的IC50为9.5μmol·L-1;当浓度为10μmol·L-1时,可抑制Caspase-9基因缺陷的成纤维细胞的凋亡(36小时凋亡率为40%,而未用药细胞为70%)。Liu等将小鼠分为治疗组和溶剂对照组,2组小鼠均行冠状动脉左前降支结扎术,20分钟后治疗组小鼠灌胃给予ucf-101(0.6～1.8μmol·kg-1),10分钟后解除结扎,使之再灌。分别于再灌3和24小时测定2组小鼠心肌细胞凋亡率和心肌梗死面积。结果显示,治疗组小鼠心肌梗死面积、细胞凋亡率及DNA损伤程度均明显低于溶剂对照组,表明HtrA2抑制剂对MIRI具有改善作用,同时也提示HtrA2可作为MIRI治疗药物开发的一个理想靶点。2.2大鼠体内caspase-3和bax蛋白水平检测磺胺苯吡唑为一种CYP2C9亚型的抑制剂,可抑制细胞色素P450介导的羟基化反应。Ishihara等在对大鼠进行冠状动脉左前降支结扎1小时后解除结扎,再灌注24小时,再灌注的同时分别给其静脉注射磺胺苯吡唑(10或30mg·kg-1)或空白溶剂,结果发现,相比于对照组,使用上述2种剂量磺胺苯吡唑的大鼠心肌梗死面积分别减少41.7%和73.2%。另有研究表明,一些选择性的细胞色素P450ω-羟化酶抑制剂可降低19-和20-羟烷四烯酸水平,抑制血管收缩,增加血流量,从而减少缺血再灌注对心肌细胞的损伤。Lv等将大鼠分为4组,分别对其腹腔注射3种P450ω-羟化酶抑制剂:17-十八炔酸(17-ODYA,0.3或3mg·kg-1)、N-甲磺酰基-12,12-二溴代十二烷基-11-烯酰胺(DDMS,0.4或0.8mg·kg-1)和N-羟基-N′-(4-丁基-2-甲苯基)-甲脒(HET0016,0.1或1mg·kg-1)或空白溶剂,10分钟后对其行冠状动脉左前降支结扎术,30分钟后解除结扎,使之再灌。再灌后2小时测定大鼠心肌细胞凋亡率及凋亡蛋白水平。结果,与溶剂对照组相比,上述3种药物可分别使大鼠心肌细胞凋亡率降低22%、31%、35%、56%、50%和67%。WesternBlot法检测结果显示,上述3种化合物均可使大鼠体内Caspase-3及Bax蛋白表达水平显著下调,并上调Bcl-2蛋白表达。由此可见,细胞色素P450ω-羟化酶抑制剂也是一种潜在理想的MIRI治疗药物。2.3对美苏氏小鼠心肌梗死面积和心功能的影响在MIRI发生时,介导心肌细胞凋亡的细胞内信号传导途径被认为与Ras蛋白有关,P38-MAPK、JNK和Mst-1这3种激酶均受Ras蛋白的调节,提示抑制Ras蛋白活性可减轻MIRI。Pando等研究表明,Ras抑制剂S-farnesylthiosalicylicacid(FTS,3)可有效减弱MIRI。该课题组取离体Wistar大鼠心脏进行冠状动脉左前降支结扎,30分钟后解除结扎,再灌注30分钟,再灌注期间分别在灌注液中加FTS(1μmol·L-1)或PBS缓冲液,结果,FTS组大鼠心脏梗死面积显著小于PBS组(12.7%±2%vs23.7%±4%,P<0.05),且心肌中JNK和Mst-1表达量下调;此外,该课题组对Wistar大鼠进行冠状动脉左前降支结扎术,30分钟后再灌注,结扎前7天每日给予FTS(5mg·kg-1)或PBS1次,在结扎后14天内,隔天给药1次。结果,FTS组大鼠的心脏梗死面积亦显著小于PBS组(17.3%±2.5%vs36%±7%,P<0.05),且FTS组大鼠心肌细胞中JNK和Mst-1的表达也发生下调。2.4主要的离子通道抑制剂心肌缺血时细胞内的无氧代谢作用增强,细胞出现酸中毒,进而促进钠氢交换,使内钠水平升高,阻碍ATP生成;此外,内钠水平升高可导致钠钙反交换增加,使细胞外钙内流,从而造成细胞内钙超载,最终诱发细胞凋亡。离子通道阻断剂可抑制这2种交换机制,故对心肌细胞具有一定保护作用。该类药物早已用于MIRI的治疗,但文献报道的以钠离子通道抑制剂和钙离子通道抑制剂为主。近来研究发现,心肌细胞膜ATP敏感性钾通道(ATPsensitivepotassiumchannel,KATP)抑制剂也能用于治疗MIRI,如Vajda等报道,与对照组相比,静脉注射选择性KATP抑制剂HMR1883(4,剂量为3或10mg·kg-1)的MIRI大鼠存活率显著提高(82%,96%vs24%),并能延长其QT间隔[(89±4.6)ms,(89±4.9)msvs(60±2.4)ms]。但另有研究人员发现,某些KATP通道开放剂如环锦熟黄杨甙D对MIRI亦有改善作用。Hu等给MIRI模型大鼠灌胃使用环锦熟黄杨苷D(20mg·kg-1),共给药3次,每次间隔为12小时。结果,治疗组大鼠心肌梗死面积明显低于未用药组(28%±4%vs48%±4%)。此外,环锦熟黄杨苷D可保护大鼠主动脉内皮细胞免受缺氧损伤,促进内皮细胞释放NO,并抑制大鼠静脉血栓形成。提示该化合物对MIRI的缓解作用可能与其开放KATP通道、刺激NO生成及抑制静脉血栓生成有关。上述研究结果显示KATP通道抑制剂及开放剂对MIRI均有一定治疗作用,但具体机制仍有待深入探讨。2.5外施pahs抑制剂线粒体F1F0ATP合酶是生物体内产生ATP的主要酶之一。研究显示,在MIRI发生时,线粒体F1F0ATP水解酶水平上调,从而导致ATP能源的大量浪费。金轮霉素B和寡霉素B可通过抑制线粒体F1F0ATP水解酶的活性阻止ATP的损耗,但两者均为非选择性抑制剂,对线粒体F1F0ATP合酶亦有抑制作用,从而影响正常组织产生ATP,故并不能用来治疗MIRI。近来,研究人员发现了一种苯并吡喃类选择性线粒体F1F0ATP水解酶抑制剂——BMS-199264(5),体外抑酶试验显示,其对线粒体F1F0ATP水解酶的IC50为0.5μmol·L-1,且在高达100μmol·L-1的浓度下对F1F0ATP合酶无任何作用。在体外试验中,向缺血大鼠心脏灌注液中加入BMS-199264(1和10μmol·L-1),结果,再灌30分钟后2个用药组大鼠心脏心率显著高于未用药组(249±22次/min,275±11次/minvs221±25次/min,P<0.05);左心室形成压升高(127±5mmHgvs18±4mmHg;125±6mmHgvs46±3mmHg,P<0.05)。结果表明,BMS-199264对心肌收缩功能有改善作用,具有开发为MIRI治疗药物的前景。2.6小鼠心肌梗死面积及内源性因子的变化近来研究表明,活化的凝血因子(FⅦa)与细胞膜上的组织因子(TF)结合形成复合物后,不仅可触发凝血酶的产生,还能影响细胞内的信号传导,故对MIRI有一定影响。已有报道称,抑制FⅦa-TF复合物活性可显著减轻MIRI,在Loubele等采用活性位点被阻断的FⅦa(activesiteinhibitedfactorVIIa,ASIS。其对TF的亲和力比天然的FⅦa更高,且因活性位点受阻,不能激活Ⅸ因子和Ⅹ因子,故而不会触发凝血连锁反应)进行的试验中,先结扎小鼠冠状动脉,1小时后解除结扎,使之再灌。结扎后15分钟和再灌后5分钟各给予1次ASIS1mg·kg-1或安慰剂。分别于再灌2、6和24小时测定小鼠心肌梗死面积以及胞内多种内源性因子水平。结果显示,ASIS组在这3个时间点的梗死面积均比安慰剂组低40%,且心肌细胞内分化抗原簇14(CD14)、Toll样受体-4(TLR-4)、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1受体相关激酶(IRAK-IL-1)和IκBа的mRNA表达量发生下调,TLR-4及核转录因子κB(NF-κB)介导的信号传导亦受到抑制。例如在再灌2和24小时时,ASIS组小鼠心肌细胞的NF-κB水平分别为(1.1±1.1)和(6.9±1.8)ng·L-1,安慰剂组分别为(7.5±2.2)和(39.0±1.8)ng·L-1(P<0.05),表明ASIS可有效阻止MIRI发生时NF-κB介导的炎症损伤;在再灌注6和24小时时,CD45阳性细胞分别降低至(164.1±35.4)和(109±23.2)个/cm2,安慰剂组为(334.0±26.9)和(323.9±36.9)个/cm2,表明ASIS可减少梗死区内白细胞的浸入。综上所述,ASIS对MIRI有较好的改善作用。2.7mel对miri的影响褪黑激素(Melatonin,Mel)即N-乙酰-5-甲氧色胺,是由位于第三脑室后壁的松果体分泌的激素,也是迄今人们所发现的最强的内源性自由基清除剂。丙二醛(MDA)生成量与氧化应激损伤程度呈正比,乳酸脱氢酶(LDH)外漏量与细胞膜损伤程度呈正比,故这两种内源性物质可作为MIRI的考察指标之一。Yeung等将SD大鼠分为Mel组(10mg·kg-1·d-1,ip,连续给药4周)、溶剂对照组和正常组,给药4周后取Mel组和溶剂对照组大鼠心脏,结扎其冠状动脉左前降支,30分钟后解除结扎,再灌5分钟时进行LDH外漏量测定,120分钟时进行丙二醛(MDA)水平、心脏梗死面积及肌内质网Ca2+-ATP酶水平测定。结果,再灌5分钟时,Mel组LDH外漏量为正常组的105%(溶剂对照组为正常组的127%);再灌120分钟时,Mel组大鼠心肌细胞内MDA水平为正常组的125%(溶剂对照组为正常组的313%);心脏梗死面积为正常组的101%(溶剂对照组为正常组的124%);肌内质