改良的2-vo法对大鼠脑永久性慢性灌注不足引起血管性痴呆模型的影响

改良的2-vo法对大鼠脑永久性慢性灌注不足引起血管性痴呆模型的影响

血管性压缩性疾病（tci）是由脑血管疾病引起的认知障碍，包括血管性压缩性疾病（vd）引起的认知障碍。与血管病变因素有关的血管性压缩性疾病的认知障碍。慢性脑缺血动物模型的建立是研究血管性认知障碍的机制和基础。双侧颈总动脉结扎法(bilateralcommoncarotidarteriesligation,2-VO)是大鼠慢性低灌注引起VD可靠的动物模型,已被广泛应用于VD研究中,其所致的病理改变主要是慢性全脑缺血,由于海马对于缺血非常敏感,损伤后常引起学习记忆功能下降,因此,常被选择作为大脑缺血后认知障碍病理学模型。虽然,传统2-VO法也能够较好的复制VD的动物模型,但术后动物由于应激性脑缺血死亡率较高,因此应对传统2-VO模型进行改良。本实验通过比较改良2-VO法和传统2-VO法制作的慢性脑缺血VD模型大鼠的学习记忆能力、运动功能、海马区及纹状体形态学改变和大鼠术后的死亡率变化,以便于为临床、药理和康复研究提供更好的VD的制模方法。1材料和方法1.1动物中心提供清洁级雄性成年SD大鼠48只,由安徽医科大学实验动物中心提供,体质量220±20g。随机分为改良模型组20只,传统模型组20只和假手术组8只。1.2主要设备Morris水迷宫实验装置(圆形水池直径150cm,高50cm;中国医学科学院药物研究所研制)。1.3大鼠慢性脑缺血vd模型的建立1.3.1术前准备1.3.2左、双侧颈总动脉的结晶和手术大鼠全麻后,仰卧固定于手术台上,先取颈部右侧旁正中切口,剪开浅筋膜,分离二腹肌、胸锁乳突肌和肩胛舌骨肌之间的肌间隙,暴露右侧的颈总动脉(commoncarotidartery,CCA)和迷走神经,分离迷走神经和颈总动脉,将右侧颈总动脉用1号手术线双重结扎,1周后取左侧旁正中切口,同样的方法结扎左侧颈总动脉,传统手术组取前正中切口,一次性双重结扎双侧颈总动脉,假手术组,同改良的手术步骤,但只分离血管不结扎动脉。手术后适量青霉素抗感染,仔细缝合,术后注意保温,常规饲养。动物苏醒后出现眼睑下垂,眼裂变小说明手术成功。1.3.3小鼠海马ca1区水迷宫试验后,大鼠用10%水合氯醛(0.3ml/100g体重)腹腔麻醉,剪开胸腔,暴露心脏,先以生理盐水约200ml经升主动脉灌注冲洗后,灌注4%多聚甲醛溶液(pH7.4,4℃),待大鼠尾变硬后取脑,将脑组织放人4%多聚甲醛溶液中固定24h后,脱水,常规石蜡包埋,海马CA1区连续切片,每片厚5μm。每只大鼠各切10张做HE染色。图像分析:在Olympus光学显微镜下对切片进行观察,在10×10倍视野下采集图像。1.4水迷对大鼠的记忆能力影响dMorris水迷宫试验:以Morris水迷宫试验检测大鼠的空间学习记忆能力。由于大鼠学习记忆功能呈进行性下降,在2个月时候明显,故在造模2个月后进行水迷宫检测,数据采集及图像分析均由图像自动监视和处理系统完成。Morris水迷宫由圆形水池、摄像机及电脑分析系统组成(由中国医学科学院药物研究所研制提供)。在水池壁标明4个入水点,由此将水池等分为E、S、W、N4个象限,任选一象限正中放置透明的塑料平台,没于水下1cm使大鼠不能见到平台,水迷宫周边贴黑色薄膜,水温控制在24±2℃。实验在隔音、较暗的房间内进行,主要进行定位航行试验和空间探索实验。(1)定位航行试验:将大鼠分别从平台以外的象限各入水点顺次放人水中,记录其在2min内寻找到并爬上平台的时间,即逃避潜伏期。逃避潜伏期越短,表明记忆能力越强。记录大鼠找到站台的时间和游泳路径。实验每天上下午各进行2次,如果大鼠在2min内未找到平台,由测试者将其引上平台并停留10s,然后取出水迷宫。对于在120s未找到平台者的大鼠,潜伏期记为120s。(2)空间探索试验:定位航行试验结束后撤出平台,然后任选一相同入水点将大鼠放入水中,测其2min内跨原平台的次数和游泳速度及距离。以游泳速度和距离测试大鼠的运动功能有无受损,穿越原平台次数检测大鼠的学习记忆能力,穿越次数越多记忆功能越好。1.5大鼠死亡率和统计学检测利用SPSS13.0软件进行统计学分析。采用(2×2)独立样本的χ2检验比较术后死亡率。大鼠行为学数据采用单因方差分析。P<0.05表示差异有显著性意义。2结果2.1传统手术组手术后12h存活率改良手术组20只,第一次手术后全部存活,第二次手术后48h存活16只,存活率为80%;传统手术组术后48h存活10只,存活率为50%;假手术组无死亡。造模后60d改良组存活15只,传统组9只,较48h都各死亡1只,见表1。2.2学习和记忆成绩持续时间造模后第60天行定位航行试验,检测逃避潜伏期,实验历时5d,前3d训练的实验数据记为学习成绩;后2d测试的实验数据记为记忆成绩。与假手术组比较,各造模组大鼠的学习和记忆成绩潜伏期明显延长(P<0.01),改良模型组和传统模型组间的学习和记忆成绩潜伏期未见差异(P>0.05),见表2。造模后第65天进行空间探索试验,记录SD大鼠2min内穿越原平台次数,游泳速度及距离。各组的游泳速度和总的游泳距离差异未见显著性(P>0.05),改良模型组和传统模型组穿越原目标平台次数与假手术组比较差异有显著性(P<0.01),但两模型组之间未见差异(P>0.05),见表3。2.3术后60d脑缺血组和传统慢性脑缺血组术后60d结构观察总评分大鼠海马CA1区HE染色显示假手术组神经元形态正常,大鼠的海马CAl区细胞排列紧密,细胞核圆而大,核仁清晰,改良慢性脑缺血组和传统慢性脑缺血组术后60d可见到海马CA1区锥体神经元排列紊乱,神经元肿胀或皱缩,锥体细胞数量减少,细胞核固缩,染色质聚集,白质区组织疏松,有胶质细胞增生现象,结构不清。见图1。3-vo对大鼠海马ca1区神经元损害的影响DelTorre等发明2-血管阻断法(2-VO),该方法结扎大鼠两侧颈总动脉造成慢性全脑的灌注不足,大脑缺血的损伤及其死亡率没有4血管闭塞法(4-VO)严重,但术后仍然存在急剧的大脑供血减少和Willis动脉环的代偿不足,有较高的死亡率,这是双侧颈总动脉结扎法的缺陷。2-VO法所致的大鼠VD模型和人类的VD机制相近,是目前最为常用的制作大鼠慢性全脑缺血的经典方法。本实验通过改良的2-VO法先结扎单侧颈总动脉,1周后再结扎对侧颈总动脉,使大鼠大脑供血减少变缓,避免了同时结扎双侧颈总动脉引起大脑血流突然急剧减少而导致的较高的应激性死亡率,从而提高了动物的术后成活率。改良组术后48h和60d的存活率较传统组明显提高。实验中发现大鼠在结扎双侧颈总动脉手术48h内死亡率及死亡数最大,是引起大鼠死亡的主要时间段,从48h后到60d,两模型组各死亡1只,死亡数明显下降。可见大鼠造模后死亡主要在48h内,其原因可能主要由于大鼠大脑供血急剧减少,而代偿性的供血未能建立而引起的急性应激性大脑缺血死亡。之后每组大鼠各死亡1只可能为慢性大脑缺血和手术损伤使大鼠抵抗力减低或者喂养中意外死亡引起。Tsuchiya等发现,双侧颈总动脉结扎2.5h后,海马、皮质和其他一些与学习、记忆功能相关的脑区局部脑血流量降低25%—87%,葡萄糖利用率下降66%—77%。永久性结扎大鼠的双侧颈总动脉,造成一种慢性脑低灌注状态,从而使脑组织产生持续性缺血,导致慢性脑缺血引起的认知功能障碍。其引起的大脑神经元死亡可以在传统的染色方法(HE染色和尼氏染色)中观察到。脑缺血1周时在传统的染色中未发现海马的CA1区的神经元损害,在2周时有6%—29%的大鼠海马的CA1区可以看到有神经元的损害[10—11],4周时增加到55%,而到8—13周增加到67%。Morris水迷宫学习记忆能力测试亦呈进行性下降。2-VO法导致的大鼠慢性脑缺血,在4周时开始出现海马的变化,主要为星形胶质细胞密度增加和在CA1区大鼠海马神经元变性、坏死和脱失,出现空间学习记忆能力的显著下降。有学者发现2-VO术后7d在Morris水迷宫任务中开始出现的学习和记忆损伤,而且空间记忆损害呈进行性发展,在电镜下可看到在海马CA1区突触密度的下降和突触超微结构改变。现代研究认为VD主要与缺血性脑血管疾病有关,是由慢性脑缺血所引起的缺氧性损害,尤其对于一些缺血敏感区域(如海马、纹状体等)影响较大,而导致学习记忆障碍。2-VO引起的记忆障碍与许多VD模型所致的认知功能障碍相比,具有慢性、持续性的特点,无运动功能的损害,更接近于临床VD患者的发病过程。因此,该模型具有重要的科学研究价值及应用价值。在本研究中改良模型组和传统模型组大鼠较假手术组定位航行试验的逃避潜伏期都明显延长,空间探索试验的穿越原平台次数明显减少,表明存在有明显的学习记忆能力减退。在HE海马CA1组织切片中可以看到两模型组都有海马区和纹状体形态学改变,表明慢性持续性缺血使大鼠的与学习记忆有关的海马区发生了缺血性损害。大鼠术后空间探索试验中2min的游泳距离和速度与假手术组未见差别,表明造模后的VD大鼠无明显运动系统损害。从中可以发现2-VO法制作的慢性脑缺血模型可以导致的大鼠的认知功能障碍,主要与记忆有关的海马区神经细胞缺血受损有关,而该模型的运动功能区无明显损害。改良后的2-VO法和传统的2-VO法在制作VD模型上没有本质的区别,都能够很好的复制大鼠的VD模型,但改良组的模型大鼠,由于避免了急剧的大脑供血减少而引起的应激性死亡,使存活率明显提高。从本实验研究可以得出,2-VO法制作的大鼠慢