DNA序列测定完整版

1DNA序列测定DNA序列测定的应用分析基因组核苷酸排列序列分析基因序列基因定点诱变的基础基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础确定DNA序列中蛋白质的编码区序列测定技术从60年代最早提出设想至今，已经日臻完善，测定序列的技术也越来越简化，在各项研究工作中的地位也日趋重要。

DNA测序之父FrederickSanger第四位两度诺奖得主唯一两获化学奖的诺奖得主唯一两获诺奖的英国人被认为是20世纪世界最伟大的科学家之一1918.8.13-2013.11.19完整定序胰岛素的氨基酸序列，同时证明蛋白质具有明确构造快速测定DNA序列的技术双脱氧终止法两次获诺贝尔奖的英国生物化学家弗雷德里克·桑格1958年获得诺贝尔化学奖1980年获得诺贝尔化学奖DNA序列测定概述即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。

1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。

70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。双脱氧链终止法工作原理Sanger双脱氧链终止法使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中，加入少量的一种双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)作为链终止剂，由于ddNTP在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基，不能与后续的dNTP形成磷酸二酯键，从而使DNA链中断。在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影，可直接读出DNA的序列。DideoxySequencingofDNAReactionRequirementsfor

DideoxySequencingofDNA

1、制备待测DNA序列模板2、酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）3、电泳分离核酸片段4、读序测序的基本过程Maxam-Gilbert化学裂解法基本原理

化学裂解（直读，Sanger双脱氧末端法也是直读法）法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，而联氨可用于肼解嘧啶环。测序技术的最近发展

1、商品化测序试剂盒解决了质粒问题，节省了时间，但缺乏灵活性。2、自动化测序仪以酶学测序反应或（和）放标测序产物为基础，微机处理。3、热循环测序使极少数测序产物线性放大。4、测序商品化￥30，搞定。标记物的种类也日益增多，除了放射性标记外，还有多种荧光标记，除了标记在特异的引物上，还可标记在ddNTP上，还可同时将四种不同的荧光分别标记在A，C，G，T上，在一个反应中完成测序，各种核酸混合物在通过荧光检测系统时，可根据四种不同荧光一次性将测序阅读完毕。SequenceAnalyzerDNA测序自动化和大规模测序特点原理同末端终止法标记物为荧光染料激光扫描自动测序结果清晰、准确、分辨率高测序速度快200bp/h

DNA自动测序与手工测序的不同点1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物2、加样方式不同：手工测序，一个样品的4个测序反应物分别在不同泳道进行，而自动测序可在一个泳道内电泳3、检测手段不同：手工测序采用放射自显影，从4种寡聚核苷酸的梯子形图谱中读出DNA序列，而自动测序则采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑

18焦磷酸测序法的原理及应用

（Pyrosequencing遗传分析技术）pyro=pyrophosphate焦磷酸

一种全新的基于酶级联反应的新型遗传分析技术;一套完整的实验方案；诸多领域的广泛应用……

Pyrosequencing遗传分析技术Pyrosequencing是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须荧光标记，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。操作较为简便。基本原理第1步：1个特异性的测序引物和单链DNA模板结合，然后加入酶混合物(包括DNAPolymerase、ATP硫酸化酶Sulfurylase、荧光素酶Luciferase和三磷酸腺苷双磷酸酶Apyrase)和底物混合物,包括过硫酸铵（APS）和Luciferin。第2步：向反应体系中加入1种dNTP，如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3’末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。第3步：在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过CCD光学系统即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶（Apyrase）的作用下发生降解。第5步：加入另一种dNTP，使第2－4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。PPiATPPrincipleofPyrosequencingAPS＋Luciferin＋硫酸化酶双磷酸酶荧光素酶oxyluciferinDetectionofthelightlighttime

C GTTCCACCT

每次向反应体系中加入一种dNTP相应位置的峰代表该种dNTP的掺入情况峰高与掺入的核苷酸数量成正比多余的dNTP在加入下一种dNTP前就被降解第二代测序技术

（Next-generationsequencing)Rothberg尝试发明一种快速便宜的测序技术。他建立的454生命科学公司（454LifeSciencesCorporation）完成的研究，结果发表在Nature杂志上。作者描述了他们这种比目前的Sanger测序方法要快100倍的技术。基本原理是焦磷酸测序法。基于Sanger测序方法的机器一般每个小时可以读取67,000个核苷酸，而该法在1小时内可以破译6,000,000个核苷酸这种称之为“454”的方法如此之快，主要是由于其自动化的原因。整个过程，全部都是采用微流技术（micorfluidictechnologies）。可以同时分析数以千计的DNA分子。Illumina/SolexaGenomeAnalyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。第三代基因测序技术

-基于纳米孔的单分子读取技术

第二代测序技术很快就遇上了强劲的对手——第三代测序技术，也就是被称为下下一代的测序（next-next-generationsequencing）的直接测序方法。该技术是基于纳米孔（nanopore）的单分子读取技术，不同于之前的两代技术，可以直接读取序列信