改良大鼠肾间质纤维化模型的建立

改良大鼠肾间质纤维化模型的建立

通过一侧切开引流管的方法生产的大鼠肾间质纤维模型得到了广泛的应用。现在，这种方法通常用于通过一侧切开管道和堵塞管道来制作肾脏间质纤维模型。然而，这种方法存在着实验动物死亡率高的缺点。本工作在单侧输尿管结扎并离断输尿管的方法的基础上加以改进,降低了死亡率,为该领域的研究提供了较新的可靠方法。1材料和方法1.1实验动物及分组健康、雄性、纯系Sprague-Dawley(SD)大鼠26只,清洁级,体重200～250g,中国科学院上海实验动物中心提供,合格证号:SCXK(沪)2003-0002。随机分为3组:正常组(n=5)、假手术组(n=5)、模型组(n=16),在上海中医药大学医学实验动物室按照SPF级饲养,自由进食和饮水。适应性饲养一周。单侧输尿管结扎手术制作肾纤维化模型。1.2肾损害部位和年龄①模型组:以水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉实验大鼠,取大鼠左侧腹肾区切口,用眼科镊分离左侧输尿管,用五号手术线,在肾盏处和肾下极处分别结扎输尿管,但并不离断输尿管,手术时注意不碰伤肾包膜并保护好周围组织,手术后把肾置于原位,逐层缝合腹膜、肌肉、皮肤。术中严格遵守无菌操作。②假手术组:除不结扎输尿管外,其余步骤与模型组相同。③正常组:正常饲养,不做处理。各组动物造模后分别于第7天、14天、21天尾经脉取血并于第28天处死取材及腹主动脉取血,留取肾脏,做相应检查。1.3血清尿素氮、胱、胱尿素的测定于单侧输尿管结扎手术后第1周、第2周、第3周和第4周,各组大鼠尾静脉或腹主动脉取血,离心取血清,采用全自动生化仪(型号为KONELAB30I)测定血清尿素氮、肌酐等。1.4大鼠体重测量每次取血前测量大鼠体重,以观察大鼠的一般状况。1.5病理检查1.5.1一般观察取材时数码相机拍照,观察各组大鼠肾大体形态的变化以及比较模型组大鼠左右肾脏的差异。1.5.2he、pasm和丽春红染色于4周末时麻醉后处死动物,留取肾组织,4%甲醛固定、乙醇脱水、石蜡包埋后制成3.5μm石蜡切片,分别进行HE、PASM和丽春红染色,光镜下观察肾小球和肾间质的变化情况。(切片机型号为LeicaRM2135,自动包埋机型号为LeicaEG1190)。1.6统计处理所有数据均以均数加减标准差x¯±sx¯±s表示。对数据进行t检验。2结果2.1两组血清bun的比较第一周,各组大鼠的血清BUN相似,组间比较差异无显著性。第二周,模型组血清BUN升高,与正常组比较有差异(P<0.01)。第三周,模型组血清BUN仍高于正常组,两组比较有显著差异(P<0.05)。假手术组与正常组的血清BUN同期比较无显著差异(见表1)。2.2两组患者时间点比较模型组大鼠的血清Cr在第一二、三周等时间点均高于正常组,同期比较有显著差异(表1)。假手术组与正常组的血清Cr同期比较无显著差异(见表1)。2.3大鼠体重测量各组大鼠的体重接近,并随着时间的推移逐渐增加,同期比较无显著差异(见表1)。2.4肾组织病理学检测见图1(彩插1),将大鼠麻醉后,剖开腹腔,观察到模型组大鼠的梗阻侧肾脏体积增大,左肾(结扎肾)明显大于右肾(对侧正常肾),肾脏表面血管增粗,包膜紧张呈半透明状,可见血块以及黄色半透明的液体。纵向剖开后内容物(血性积液)流出,仅存一层薄肾皮质及包膜。梗阻侧肾脏剖面观可见肾盂扩张明显,内有出血。2.5小鼠肝肾组织结构见图2、3(彩插1),模型组大鼠大部分肾小球呈玻璃样变,硬化的肾小球周围所属肾小管萎缩、基底膜增厚,部分肾小管消失;少数残存的肾小球肥大并周围肾小管扩张严重;肾间质胶原纤维增生和大量炎细胞浸润。3实验结果与分析尽管口服或腹腔注射氯化汞可造成大鼠的肾间质纤维化,但大鼠单侧输尿管结扎模型仍是研究肾间质纤维化较理想的动物模型之一,但现在一般采用的大鼠单侧输尿管结扎手术方式基本上是从大鼠背侧入腹。通过对肾蒂及输尿管走行辨认输尿管,进行肾盂输尿管连接部以及输尿管肾下极处的结扎,并从两个结扎处中间离断输尿管,这种手术方法造成的肾间质纤维化模型存在造模大鼠手术后存活率低的缺陷,考虑原因为:①传统输尿管结扎手术,手术切口较长,2～3cm,手术侧肾脏多次受到手术器械的牵拉,术后易与周围组织形成粘连。②背侧入腹需分离肌肉,并且创口较深,难以辨别输尿管,造成手术时间较长,加重了手术感染的危险。本实验在此基础上对手术方法加以改进,改为侧腹切口结扎输尿管,切口可控制在1～2cm,并把离断输尿管改为不离断输尿管,右侧卧位的大鼠极易分离左肾输尿管并结扎,手术时间大为缩短,大鼠所受损伤也相应减轻。经改进的手术方法所作的大鼠模型术后造成梗阻性肾病模型的病理检查结果显示:模型组大鼠大部分肾小球呈玻璃样变,硬化的肾小球周围所属肾小管萎缩、基底膜增厚,部分肾小管消失;少数残存的肾小球肥大并周围肾小管扩张严重;肾间质胶