植物源性非致病性镰刀菌的诱变育种研究

植物源性非致病性镰刀菌的诱变育种研究

f.oxystan是一种非常重要的经济土壤传染源。国内对该病原菌引起的病害多采用农业防治法,但由于存在生理小种的分化,抗病品种也不能长期有效,尤其是保护地种植,轮作困难,导致病害发生严重,经济效益下降。有些种类的作物通过嫁接方法虽然能有效地控制病害,但其缺点是栽培成本增加,同时导致产品风味不同程度异化。发达国家应用土壤熏蒸消毒的方法虽然效果很好,但所用药剂对环境毒性高,有些药剂还导致大气臭氧层的破坏,已逐渐被禁止使用。这就要求开发新的有效的替代方法。抑病土是可以阻止作物重茬栽培土传病害发生的一种土壤类型,通过对枯萎病抑病土抑病因子研究发现,抑病土除自然的物理化学因素外,土壤拮抗性微生物——木霉、粘帚霉、荧光假单孢杆菌、非致病性镰刀菌等是抑病主要因子。多种微生物作用的比较研究证明非致病性镰刀菌是防效最好、最稳定的生物因子。起作用的非致病性镰刀菌有腐生性的镰刀菌和与病原同型非致病型菌,研究表明,非致病性镰刀菌作用机制是微生物间互作、诱导抗性或两者兼备。非致病性镰刀菌可以从自然抑病土中分离,作者从2000年开始即采用紫外线诱变的方法获得黄瓜和甜瓜的非致病性镰刀菌,并对其生防潜力进行了初步研究。1材料和方法1.1甜瓜枯病病原菌分离培养黄瓜枯萎病菌(F.o.f.sp.Cucumerinum)甜瓜枯萎病菌(F.o.f.sp.Melon)以上两种病原菌由田间病株上分离,在本实验室低温保存。1.2试验品种黄瓜:山东密刺;甜瓜:齐甜1号。1.3紫外线诱变剂的制备紫外线诱变方法参照文献。镰刀菌分生孢子悬浮液为2×104个/ml。在照射的前5min内,每隔1min吸出50μl加入到载有PD液体培养基的凹片中,置于25℃恒温箱中黑暗和光照两个条件下做萌发率试验,作出紫外线照射剂量与萌发率的变化曲线,用杀死95%～99%分生孢子的紫外线剂量作为本实验的诱变剂量。1.4培养pda平板用1.3中选定的紫外线照射剂量分别处理过的黄瓜和甜瓜镰刀菌分生孢子悬浮液0.5ml均匀涂在PDA培养基平板上,然后置于25℃恒温培养箱中培养,待见到菌丝出现后,挑取单菌落转移到新的PDA平板上培养。非致病性镰刀菌的筛选用毒素对幼根的毒性和苗期根部接种分生孢子两种方法。1.5瓜苗土里高效喷药致病性刀菌毒力将在营养钵内培养30d左右苗龄的黄瓜和甜瓜苗定植于直径21cm、深30cm的瓦盆中,消毒盆土配比为:田土∶鸡粪肥=10∶1。瓜苗定植时,瓦盆中先填装一半左右消毒土,用喷雾器将致病性镰刀菌的分生孢子悬浮液1ml(孢子浓度:107个/ml),均匀地喷在土面上,然后在瓜苗土坨的周围喷上相同浓度的非致病镰刀菌诱抗菌系5ml(孢子浓度均为:107个/ml)。以仅接种1ml致病菌作为CK1、不接菌空白作为CK0,每处理5盆,重复4次,以病株率、生长末期根部鲜重、株高、产量等为指标进行比较。2紫外线诱变型菌株的筛选结果2.1紫外线诱变剂量确定经紫外线照射不同时间的两种镰刀菌分生孢子24h萌发率见图1、图2。两种病原菌的分生孢子接受紫外线后,光、暗两个处理萌发率的变化趋势是一致的,在照射3min时,孢子萌发率快速下降,之后孢子萌发率下降较慢;但相同的照射剂量下,无论照射后是否光、暗处理,10min后大部分分生孢子都被杀死。照射后光照培养条件下孢子萌发率较高。这一现象表明光修复的作用还是非常明显的。所以后面的诱变后的分生孢子于黑暗条件下培养。2.2.1经诱变分离的单孢菌系的致病性测定结果分别分离了经紫外线诱变的黄瓜和甜瓜镰刀菌单孢菌系各100个,黄瓜镰刀菌PD液体培养提取液对根的作用可以分为三种类型:第一种表现为高毒性,与野生型菌系提取液的作用方式相同,即胚根刚露出种皮即中毒死亡,根尖及子叶部分组织松散;第二种表现为弱毒性,即幼根生长明显受抑制,有的表现根尖发黄,根畸形等;第三种表现为无毒性或有一定的刺激须根生长的作用。从表1中的结果可以看出:黄瓜枯萎病菌经紫外线照射后毒性减弱的比例很高;甜瓜枯萎病菌则变化比例较低。2.2.2无毒菌系对黄瓜、甜瓜苗期致病性鉴定结果分别用2.2.1中获得的黄瓜、甜瓜的弱毒和无毒菌株菌株接种幼苗,致病性鉴定结果与菌株毒性测定结果是一致的。接种14d后致病菌系接种的幼苗子叶开始变黄、植株枯死,弱致病菌系则导致部分接种幼苗死亡,非致病菌系接种幼苗都很健康。镜检根部组织内部的镰刀菌菌丝,发现病株及健株均已被镰刀菌侵染,证明接种方法是成功的。不同的是病株中的致病型镰刀菌导致根部细胞死亡,且菌丝很多,并在已褐变的组织区域内形成大量的厚垣孢子;健株根组织中非致病性镰刀菌菌丝很少,而且只有少数须根被侵染,形成的厚垣孢子也很少。2.2.3诱抗保护作用测定结果部分非致病菌系及处理病株率等测定指标结果列于表2中。表2中列出的黄瓜的非致病菌系是选择的后备菌系中在整个生长季不但对枯萎病有很好的保护作用。非致病菌系接种的植株根系发达,色白,健康状态明显优于CK0,而且对霜霉病、黑星病也有很好的保护作用,在自然发病条件下,两者的病情指数小于15,其它处理的病情指数在20～50之间。两种非致病菌系对根鲜重、株高、产量等都有明显的刺激作用。虽然甜瓜的非致病菌系较少,但其保护作用也是很理想的,其它作用有待诱变筛选出更多的非致病菌系后进一步研究。3非致病性镰菌的诱导抗性本文初步证明了用紫外线诱变黄瓜、甜瓜尖孢镰刀菌获得具交互保护作用的非致病菌系是可行的,但两种不同专化型的镰刀菌经紫外线照射后获得弱致病性和非致病性菌株的比例相差较大,其内在原因有待进一步研究。在诱抗接种的黄瓜植株上还观察到有些菌系对前期黑星病(Cladosporiumcucumerium)和后期的霜霉病(Pseudoperonosporacubensis)(定植40d以后)。此外,同时还进行了一些对枯萎病菌有拮抗作用的芽孢杆菌和放线菌防治枯萎病实验,也取得非常理想的结果。这些结果为由镰刀菌引起多种作物枯萎病的生物防治提供了广阔的前景。在最近10年里,已有许多关于非致病性镰刀菌诱导抗性机制的研究报道,在分子机制上,接种非致病镰刀菌后可以很快激活多种防御性酶的活性;从非致病镰刀菌在根部的有限生长的结果上可以假设:被接种的植物还可能具有