大鼠永久性脑缺血模型的三种手术方法比较

大鼠永久性脑缺血模型的三种手术方法比较

中风是世界上的第三百个致命疾病，也是全世界研究的重点。在对人类脑卒中的研究过程中,制作稳定性强、重复性高的大鼠脑缺血模型是十分必要的。由于大鼠脑血管特征与人类比较相似,因此较多的被选用来进行一些临床药物的实验。但是在制作大鼠脑缺血模型的过程中,由于各个实验室的条件及其操作人员的个人因素,致使制作模型的时间较长,而且无法得到一个比较稳定的动物模型,其中动物的术后死亡率及其脑缺血面积的不稳定性始终是困扰着广大实验人员的问题,从而也就无法保障随后实验的顺利进行。本课题组通过数百只大鼠脑缺血模型的制备,总结了一种高效稳定的制作大鼠永久脑缺血模型的方法,在这里介绍如下。1材料和方法1.1药物、试剂和线栓SPF级SD雄性大鼠100只,体质量240～260g,购自北京协和医院动物实验中心【SCXK(京)2007-0001】。固体水合氯醛购自国药集团化学试剂有限公司,使用前用蒸馏水配成10%的水合氯醛溶液。固体2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)购自北京化学试剂公司,使用前用蒸馏水配成2%的TTC溶液。线栓采用0.24mm的强力鱼线,长度为5cm,一端用加热法烧成球形,避免在栓塞过程中刺破血管壁,将其浸泡至酒精中备用。手术过程均在德国Leica手术显微镜下进行。1.2实验动物的关怀无菌手术在北京协和医学动物实验中心屏障动物实验设施进行【SYXK(京)2005-0008】,并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。饲养室温度控制在20～22℃,明暗光照12h∶12h。手术前动物自由饮水和进食,手术按外科无菌原则操作。腹腔内按每100g体重0.2mL注射10%水合氯醛麻醉大鼠。动物恒温毯设定温度为37℃,于术中保持动物体温恒定,核心体温通过肛温进行监测。1.2.1颈内动脉和颈内动脉分离颈部正中切口,在左右颌下腺间剪开阔筋膜,在右侧胸锁乳突肌和颈前肌群之间向深部分离,显露深面的颈总动脉(CCA)、向上逐渐分离颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)、甲状腺上动脉起始部、枕动脉起始部。1.2.2颈内动脉走行方向深部分离采用改良的ZeaLonga法剥离颈内动脉和颈外动脉分叉处的迷走神经节,顺着颈内动脉走行方向向深部仔细分离,暴露出翼腭动脉及其与颈内动脉的分叉处。依次结扎颈总动脉近心端、颈外动脉起始部(甲状腺上动脉分支之前)、枕动脉和翼腭动脉。用动脉夹夹住颈内动脉段阻止血液返流。1.2.3线栓的预防大体步骤同1组,但是暴露枕动脉和翼腭动脉后并不结扎,在送入线栓的过程中,可以在显微镜直视下将线栓越过翼腭动脉开口处而送入颈内动脉。颈内动脉在插入线栓前,用一丝线将其悬挂而并非用动脉夹阻断。1.2.4彩插线栓的使线栓进入保护域大体步骤同1组,但是不暴露翼腭动脉,颈内动脉通过悬挂丝线的方式将其阻断。线栓插入通过盲插的方式,但是在线栓进入0.5cm的时候,应往下轻压线栓使其远端稍稍翘起,从而避开翼腭动脉的开口处(如图1、2所示,图2见彩插2。),使线栓顺利的进入颈内动脉。三组大鼠均在颈总动脉距离分叉处5mm处,用显微剪刀剪开动脉壁,送入线栓约1.8cm,结扎固定线栓。1.3综合评价大鼠脑缺血24h后采用改良的NSS评分量表对其进行盲评,共18分,分数越高说明大鼠神经功能缺失越重。9～12分表示造模成功。1.4脑缺血面积的测定大鼠脑缺血24h后,深麻醉断头取脑,-80℃冷冻后行冠状切片,从额极至中脑依次切成6块,每块平均厚度为2mm。将切片迅速浸入2%的TTC溶液中,37℃孵育30min,孵育过程中每隔5min将切片翻转一次,保持染色均匀。染色后将脑片浸泡在0.01mmol/L的PBS溶液中,用数码相机采集图片,然后用ImageJ软件对脑缺血的面积进行计算。为了避免因为脑水肿引起的误差,采取下面的计算公式:右半球梗死面积=左半球脑面积-(右半球脑面积-右半球梗死面积)。1.5灌胃水辅助治疗将造模术后评分为10分的脑缺血大鼠随机分为2组,分别在第1天和第3天给予10%的葡萄糖生理盐水灌胃每只2mL和腹部皮下注射每只1mL,连续给3d,观察术后辅助治疗对大鼠的存活及体重恢复的影响。1.6均数的确定sxs全部资料通过SPSS13.0统计软件包进行统计学分析。各组数据均以x¯±sx¯±s表示。采用单向方差分析(One-wayANOVA)方法中的Bonferroni法进行各组均数的多重比较(posthocmultiplecomparisons)。P<0.05认为统计学差异具有显著性意义。2结果2.1组大鼠死亡率比较术后24h观察脑缺血大鼠的存活情况。从表1中我们可以看到在术后24h,第3组的大鼠均存活,存活率为100%,在第1组和第2组死亡率为20%和10%。术后48h,第1组、第2组和第3组死亡率分别为40%、20%、10%,第3组死亡率和第1组相比差异具有显著性(P<0.05)。截止到术后1周观察,第3组大鼠共有2只死亡,死亡率为20%,第1组共有5只死亡,死亡率高达50%,第2组共有4只死亡,死亡率为40%。第3组的手术死亡率显著低于第1组(P<0.01),第3组和第2组相比(P<0.05)。2.2组不同手术方法的实验组nss评分比较造模术后24h后对各组大鼠进行NSS神经功能评分。从图3中我们可以看出,在三组不同手术方法的实验组,每组10只大鼠的NSS平均评分为1组12分,2组11分,3组10分,三组相比没有统计学差异,但是从表2中我们可以看出1组和2组的手术个体之间NSS评分的差异是比较大的,而3组的差异则比较小。2.3脑缺血体积测定造模术后24hTTC染色检测脑梗死体积,结果见图4。24h后三组脑缺血的体积平均为431.639mm3、413.285mm3、401.732mm3。三组之间没有明显差异。2.4手术时间和预后通过在手术过程中,对手术开始时间和结束时间的统计,计算出三组手术方式所花费的时间,如图5。1组和2组因为要分离翼腭动脉,所以分别要平均花费50min和40min,而3组的手术方式不必分离翼腭动脉,也不必结扎,所消耗的时间主要是分离血管的时间,所以平均只需要花费17.5min的时间就可以完成,3组的手术时间同其他两组相比差异具有显著性(P<0.05)。2.5大鼠体重和体重变化情况大鼠术前平均体重为250g,行脑缺血模型术后第1天,两组动物的体重均有显著降低,降低大约20g左右。灌胃组(组1)自术后1d给予10%葡萄糖盐水及腹部皮下注射,每天两次,可以看到体重下降的幅度减慢并且在3d后开始出现体重增加。随着时间的推移灌胃组大鼠体重可见不断恢复,毛色逐渐恢复光泽,2周后平均体重可恢复到220g左右。而对照组(组2),大鼠的体重呈持续降低的趋势,2周后体重降至180g,而且可以发现该组大鼠的毛色发暗,动物没有精神,比较瘦小。此外,灌胃组术后死亡3只,对照组死亡5只。见图6。3模型制备与模型评价本实验在采用第2种和第3种手术方式时,不结扎枕动脉和翼腭动脉,在插入线栓过程中,并未见到有动脉血返流,对插入线栓的影响不大。通过这种方法保证了大脑中动脉灌注以外部位的有效血流,降低了周围血流减少对大鼠脑缺血模型稳定性的干扰。在阻断颈内动脉血流时,采取用丝线悬挂的方法,减少了动脉夹阻断血流时对血管壁的损害。这样做的另外一个好处是,如果在插入线栓的过程中出现颈内动脉血的返流,可以及时对颈内动脉进行提拉,阻止血流的进一步返流,保证手术视野的清晰。第2种手术方法虽然可以保证将线栓准确的送入颈内动脉,避开翼腭动脉开口处对操作的影响,但是由于翼腭动脉比较深在,在分离翼腭动脉时,容易对周围的神经及组织造成牵拉和损害,引起大鼠较剧烈的刺激反应,从而会影响术后大鼠对脑缺血的耐受,造成死亡率的提高。此外,因为在制作模型的过程中,第3种方法没有分离翼腭动脉,在减少了对周围神经损伤的同时,节约了大量的时间,使模型制备的时间限制在20min以内(图5),与我们课题组以往工作相比,模型制备的效率有所提高,并且减少了因为手术时间过长对大鼠机能的损害,从而也保证了模型的稳定性。本实验对三组大鼠术后进行了神经功能NSS评分,从平均评分来看,三组的结果并没有显著差异,但是我们从图3曲线图中可以看到,采用第3种方法的脑缺血模型评分更加的趋于稳定,可以保证在后续实验中动物模型入选的标准统一。第1组和第2组手术方法制作的脑缺血模型个体之间评分波动幅度较大,增加了后续实验的干扰因素,从而会对最后的实验数据造成影响。图4中通过对三组脑缺血模型梗死体积的计算,发现三组之间并没有显著差异,说明采用3种手术方法均可以达到满意的梗死体积。最后我们选取了NSS评分相近的脑缺血大鼠模型分成两组,一组自术后1d给予高糖盐水灌胃和腹部皮下注射,并且与不给予任何干预措施的对照组进行比较。从图6中我们可以看到,各组大鼠在术后3d内体重均有明显的降低,考虑与大鼠术后脑水肿导致停止进食及饮水,机体严重脱水有关。如果在此时不给予任何辅助措施的情况下,单靠大鼠本身对脑缺血的对抗,往往会导致较高的死亡率。但是在给予高糖盐水组中,脑缺血大鼠的体重在4～5d的时候即出现少许的提高,并且随着时间的推移,大鼠的体重会逐渐稳定的回升。但是由于脑缺血的原因,大鼠的体重在我们的观察时限内,并不能够恢复到与术前相当的体重。此外我们还观察到,在大鼠体重开始恢复的同时,其本身的进水和饮食能力也逐渐恢复,在这种情况下,我们就可以逐渐减少或停止对大鼠的灌胃。从图6中我们可以看到未进行任何辅助措施的对照组大鼠,其体重在观察时限内呈持续性降低的趋势,并且在这一过程中不断的有大鼠死去,考虑是因为自身无法补充水分及营养过度消耗致死。因此,在大鼠脑缺血模型制备后,及时的给予一定量的高糖盐水的补充,对于大鼠体重的恢复及生存率有较大